1、ICS 65.020.30 B 41 DB37 山东省地方标准 DB 37/T 20382012 牛尿苷酸合酶缺乏症（DUMPS）分子检测 技术规程 Technical specification of detection for deficiency of uridine monophophate synthase in bovine 2012 - 02 - 09 发布 2012 - 03 - 01 实施 山东省质量技术监督局 发布 DB37/T 20382012 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出。 本标准由山东省畜牧业标准化技术
2、委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、山东省畜牧总站、山东奥克斯生物技术有限公 司。 本标准主要起草人：李荣岭、张思聪、王洪梅、李秋玲、李建斌、黄金明、鞠志花、王长法、侯明 海、曲绪仙、仲跻峰。 DB37/T 20382012 1 牛尿苷酸合酶缺乏症（DUMPS）分子检测技术规程 1 范围 本标准规定了牛DUMPS分子检测的技术方法。 本标准适用于牛DUMPS分子检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682-2
3、008 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 1672-2008 绵羊多胎主效基因FecB分子检测技术规程 SN/T 1193 基因检验实验室技术要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 尿苷酸合酶缺乏症 deficiency of uridine monophophate synthase 尿甘酸合酶缺乏症是由于牛体内尿苷酸合酶（Uridine Monophop hate Synthase，UMPS）基因的C- 末端405处的密码子存在一个点突变，使编码精氨酸的密码子CGA转变为终止密码子UGA引起。 3.2 限制性内切酶 restriction endonuclease
4、 限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。 3.3 限制性片段长度多态性 restriction fragment l ength polymorphism (RFLP) 限制性片段长度多态性是根据基因组上限制性内切酶切位点核苷酸发生突变， 或酶切位点之间发生 核苷酸的插入、缺失而导致酶切片段长度发生变化，对基因突变进行检测的一种方法。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribon ucleic acid） DB37/T 20382
5、012 2 dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyri bonucleoside triphosphate） bp：碱基对（base pair） 5 检测原理 尿甘酸合酶缺乏症是由于奶牛体内尿苷酸合酶（UMPS）基因的C-末端405处的密码子存在一个点突 变（碱基1碱基2），使编码精氨酸的密码子CGA转变为终止密码子的UGA，导致含有纯合突变基因型的 胚胎早期死亡。基于这个点突变设计引物对该区域进行PCR扩增以及RFLP分析，由于野生型与突变型个 体的基因片段的长度存在显著差异，因而，通过PCR-RFLP分析会在聚丙烯酰胺凝胶上产生不同的带型， 可根据奶牛个体在凝胶中呈现带型的不同来判断被检测个
6、体的基因型。 6 主要试剂 除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T 668 2-2008的双蒸水；高压灭菌条件为1.034 105Pa压力，蒸汽灭菌20min。试剂及配制方法见附录A。 7 主要仪器设备 主要仪器设备见附录B。 8 检测方法 8.1 样本采集 静脉采集血样35mL，ACD抗凝，-20保存。公牛可用23剂细管精液，-196保存。 8.2 基因组 DNA 提取 8.2.1 血样中 DNA 的提取 提取方法见附录C。 8.2.2 精液中 DNA 的提取 提取方法见附录D。 8.3 基因组 DNA 检测 具体按照 NY/T 1672 -2008的规定执行。 8.4 引物的设计
7、与合成 上游引物：5-GAACATTCTGAA TTTGTGATTGGT-3； 下游引物：5-GCTTCTAACTGA ACTCCTCGAGT-3。 扩增产物大小为95 bp。 8.5 PCR 扩增 8.5.1 PCR 扩增体系 DB37/T 20382012 3 PCR扩增反应总体积为20L，其中10PCR Buffer(含15 mmol/L的Mg2+)2.0L，10 mmol/L dNTPs 0.5L，10 pmol/L的上、下游引物各0.5L， Taq DNA聚合酶1 U，DNA模板100 ng，加双蒸水至20 L。 8.5.2 PCR 扩增循环参数 PCR扩增条件：94预变性3 min
8、；94变性20s，60 退火20s，72延伸30s，35个循环；72终 延伸5min，4保存。 8.5.3 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳检测 琼脂糖凝胶制备需要胶板、隔板、微波炉、三角瓶和多齿梳子、一次性手套等。先用水清洗制胶板， 再用1TAE冲洗一次，水平放置。称取1 g的琼脂糖，溶解于100 mL 1TAE中，在微波炉中加热融化至 溶液澄清透明，室温下冷却至60左右时，加 入溴化乙锭并混匀，使其终浓度为0.5 g/mL，即得1 的琼脂糖溶液。将混合液缓慢倒入制胶板中，排除气泡，插入多齿梳子。待凝胶凝固后，拔出梳子后将 凝胶转移至水平电泳槽中， 往电泳槽中加入1TAE缓冲液， 使电泳缓冲液没过
9、胶面。 将待检PCR产物5 L 和上样缓冲液（6DNA Loading Buffer）以5:1的比例混合均匀，加入点样孔，同时选择点样孔点上5 L 2000 bp DNA Marker作参照。恒压1 00 V，电泳20 min。电泳结束后于凝胶成像系统观察,并分析记录。 8.6 RFLP 分析 8.6.1 RFLP 酶切体系 10L酶切体系： PCR产物1.0 L，限制性内切酶AVaI（10 U/L）0.3 L，10Buffer 1 L， 超纯水8.7 L，37水浴消化过夜。 8.6.2 RFLP 产物聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 酶切产物用12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，200V电泳，2 h后硝酸
10、银染色照相，记录基因分型。聚 丙烯酰胺凝胶电泳和硝酸银染色的操作步骤见附录E。 9 结果判定 9.1 PCR 扩增产物检测 扩增产物大小为95 bp，条带清晰（见图1），可进行下一步检测。 图1 UMPS 基因 PCR 扩增结果（DL2000 DNA Maker） DB37/T 20382012 4 9.2 PCR-RFLP 结果 UMPS基因经酶切后，根据RFLP图谱分为2种基因型：正常基因纯合子（-/-），携带突变基因的杂合 子（-/+），如图2（另有21bp酶切片段由于片段较小，电泳中没有显示）。 图2 酶切产物 SDS-PAGE 电泳结果（5 0bp DNA Lander） 10 废弃
11、物的处理和检测过程中防止交叉污染的措施 按照NY/T 1672-2008和SN/T 1193 执行。 DB37/T 20382012 5 A A 附 录 A （资料性附录） 主要仪器设备 A.1 凝胶成像分析系统 A.2 单道可调移液器：2 L，10 L，20 L，100 L，200 L，1000 L A.3 基因扩增仪 A.4 离心机 A.5 恒温振荡器：0 r/min 200 r/min，060 A.6 电子天平：量程 0.001 g 100 g，感量 0.001g A.7 旋涡混合器 A.8 手持式均质器 A.9 紫外分光光度计 A.10 凝胶成像分析系统 A.11 稳压稳流电泳仪 A.
12、12 水平电泳槽 A.13 高压灭菌锅 A.14 自动双重纯水蒸馏器 A.15 微波炉 A.16 干燥箱 A.17 -20冰箱 A.18 恒温水浴锅 DB37/T 20382012 6 B B 附 录 B （资料性附录） 试剂及配制方法 B.1 ACD抗凝剂 柠檬酸0.48g、柠檬酸钠1.32g、葡萄糖1 .47g，用双蒸水定容至1000mL，高压灭菌。 B.2 10SDS (10十二烷基磺酸钠) 称取SDS 2g，加超纯水18mL，加热至68助溶，加HCl调pH至7.2。 B.3 蛋白酶K (20mg/mL) 200 mg蛋白酶K溶于10 mL水中，以1 mL分装，-20 保存。 B.4 T
13、E溶液 即1 TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA, pH8.0)。取1mmol/L Tris-HCl 10mL，0.5mmol/L EDTA 0.2mL，用双蒸水定容至100mL，高压灭菌。 B.5 1mol/L Tris-HCl缓冲液 在800mL水中溶解121.1g T ris碱，加HCl调pH值至8.0，用双蒸水定容至1000mL，分装后高压灭菌。 B.6 0.5mol/L EDTA(pH8.0) 称取乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na 22H2O) 18.61g，NaOH 2g，加水至80mL，在磁力搅拌器上剧烈搅拌， 完全溶解后定容至100mL，
14、高压灭菌。 B.7 血液DNA提取液 10mmol/L TrisCl（pH 8.0）、0.1mol/L EDTA(pH8.0)、0.5SDS。 B.8 冷冻精液DNA提取液 10mmol/L TrisCl（pH 7.4）、10mmol/L NaCl、0.1mol/L EDTA(pH8.0) 、1%SDS、2 -巯基乙醇。 B.9 3mol/L NaAc（pH5.2） 在80 mL双蒸水中加入40.81g醋酸钠，用醋酸调节pH值至5.2，加水定容至100mL。 DB37/T 20382012 7 B.10 4mol/L NaOH 80g NaOH溶于400mL水中，定容至500mL，高压灭菌；
15、B.11 50TAE 750mL双蒸水中溶解242g Tris碱，加入57.1mL乙酸，100mL的0.5mol/L的EDTA（pH8.0），用双蒸水 定容至1000mL。 B.12 溴化乙锭EB（10mg/mL） 10mL双蒸水加入0.1g EB，完全溶解后避光保存，4保存。 B.13 琼脂糖电泳上样品缓冲液 0.25溴酚蓝，0.25二甲苯青FF，40（w/v）蔗糖溶液。 B.14 10TBE Tris Base 54g、硼酸27.5g、EDTA (0.5M) pH8.0 20ml，加超纯水至1L。 B.15 1琼脂糖凝胶溶液 取琼脂糖1g、10 TBE 20mL、EB 5 L，加超纯水定容
16、至100mL。 B.16 10过硫酸铵 1g过硫酸铵溶解于10mL水中，4保存。 B.17 30丙烯酰胺（49：1） 丙烯酰胺147g和N，N -亚甲双丙烯酰胺3g溶解于400mL水中，将溶液加热至37溶解，完全溶解后 定容至500mL，置棕色瓶中4保存。 B.18 变性剂 95甲酰胺，10mmol/L EDTA，0.05溴酚蓝。 B.19 0.1AgNO 3溶液 1g AgNO3用水溶解后，定容至1L。 B.20 2碳酸氢钠显色液 DB37/T 20382012 8 称取10g NaHCO 3，溶解于400ml蒸馏水中，加2mL甲醛，加水至0.5L，充分溶解混匀，现用现配。 B.21 氯仿:
17、异戊醇（24:1） 异戊醇21 mL加入到500 mL氯仿中，混匀。 B.22 酚：氯仿：异戊醇（25:24:1） 酚、 氯仿和异戊醇按照体积比25:24:1混合， 保存于4棕色瓶中， 并处于0.1mol/L Tris cl(PH8.0) 覆盖之下。 DB37/T 20382012 9 C C 附 录 C （资料性附录） 血液中 DNA 的提取方法 C.1 取 1mL全血融化，加入等体积PBS缓冲液。 C.2 混匀 10 min，12 000 rpm离心 5 min，弃上清，重复 3 次。加入 500 L抽提缓冲液，悬浮沉淀， 加入RNase A终浓度 20 g/mL，37水浴 1h。 C.3
18、 加入蛋白酶K，其终浓度为 100 g/mL，56水浴温和振荡，消化完全，至不见粘稠团块。 C.4 加入等体积Tris饱和酚、温和颠倒混合至少 5 min，12 0 00 rpm、4离心 8 min；取上清，同上， 重复抽提。 C.5 取上清，加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)混合液，同上，重复抽提；取上清，加入等体积 氯仿:异戊醇（24:1） ，同上，重复抽提。 C.6 取上层水相，加入等体积的异丙醇（-20） ，沉淀DNA，水平轻摇即可看到絮状DNA沉淀，12 000 rpm、4离心 2 min。 C.7 加入 1mL 75的冰乙醇（-20）洗涤DNA沉淀 2 次，12 000
19、 rpm、4离心 3min。 C.8 小心倒掉乙醇，用吸水纸残留的乙醇，将离心管倒扣于纸巾上，置于 37温箱干燥 15 min。 C.9 待乙醇完全挥发(注意不要太干)，加入 100-200 L TE溶解，4保存。 DB37/T 20382012 10 D D 附 录 D （资料性附录） 冷冻精液 DNA 的提取 D.1 将冻精细管从液氮罐中取出，37 水浴快速解冻，收集精液至 1.5ml离心管中，加入 1mL缓冲液清 洗，8000 rpm离心 5 min，弃上清，重复 3 次。 D.2 加入 500 L抽提冷冻精液缓冲液悬浮沉淀物，加入蛋白酶K至终浓度为 100 g/mL，混匀，于 37 消
20、化 4h。 D.3 加入等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24: 1)抽提，12 000 rpm、4离心 12 min D.4 将上清用氯仿:异戊醇(24:1) 抽提，12 000 rpm、4离心 12 min。 D.5 取上清，加入 2 倍体积的无水乙醇（-20）,沉淀DNA，12 000 rpm、4离心 2 min。 D.6 加入 1ml 75%的冰乙醇（-20）洗涤DNA 2 次。 D.7 小心倒掉乙醇，用吸水纸残留的乙醇，将离心管倒扣于纸巾上，置于 37温箱干燥 15 min。 D.8 待乙醇完全挥发，加入 100-200 L TE溶解，4保存。 DB37/T 20382012 11 E
21、E 附 录 E （资料性附录） 聚丙烯酰胺凝胶电泳 E.1 凝胶板的制备 清洗制胶玻璃板，用蒸馏水清洗干净，擦干后，用夹子夹好。 E.2 聚丙烯酰胺凝胶的配置 量取30丙烯酰胺（49：1）溶液10 .0mL，5 TBE 5.0mL, 10过硫酸铵0.1 8mL，TEMED0.016mL， 混匀。 E.3 灌胶 将玻璃模具倾斜，将胶缓慢注入两玻璃板间的空隙中，直至注满模具顶部，避免产生气泡。 E.4 插梳 立即插入相应的点样梳，将胶板水平放置，室温静置20- 60 min以待凝胶聚合，在此过程中，添加 少许凝胶，以避免凝胶在聚合过程中的回缩。 E.5 预电泳 凝胶聚合后，撤掉底边的边条，将胶板夹
22、到电泳槽上，并在槽中加入1 TBE的电泳液，用注射器冲 洗加样孔，清洗尚未完全聚合的残胶。用180V电压预电泳10min。 E.6 上样 将样品与上样缓冲液按6：1混合，加样于点样孔，并加入DNA分子量标准的DL2000 Marker。做较多 样品检测时，可在不同板中将Marker加样于不同位置，以将板区分开，避免样品的混淆。 E.7 电泳 根据扩增片段的大小及电泳槽和凝胶的大小决定电泳的电压及电泳时间，电压通常是18V/cm，电 泳时间34h。 E.8 染色 电泳结束后，取下电泳胶板，小心取下一面玻璃，将附有凝胶的玻璃板悬于染胶盘上方2030cm， 使凝胶朝下。用胶条小心掀起凝胶一角，使凝胶轻轻放入染胶盘内。将胶用双蒸水中漂洗2次，每次10 DB37/T 20382012 12 20s；经10乙醇固定10min，双蒸水中漂洗2次；加入1AgNO 3银染，避光轻摇染色30min，双蒸水漂洗； 加入显色液（含2NaCO 3和0.4甲醛）显色，4乙酸终止染色，双蒸水漂洗2次，基因型分型。 _
