1、ICS 65.020.30 B 41 DB37 山东省地方标准 DB 37/T 20322012 布鲁氏菌病竞争酶联免疫吸附试验 诊断技术 Competitive Enzyme-linked Immunoassay Diagnostic Criteria on Brucella Infection 2012 - 02 - 09 发布 2012 - 03 - 01 实施 山东省质量技术监督局 发布 DB37/T 20322012 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由山东省农业科学院提出。 本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省
2、农业科学院奶牛研究中心、山东省动物疫病预防与控制中心。 本标准主要起草人：杨宏军、田夫林、何洪彬、侯明海、仲跻峰。 DB37/T 20322012 1 布鲁氏菌病竞争酶联免疫吸附试验诊断技术 1 范围 本标准规定了动物布鲁氏菌病竞争酶联免疫吸附试验诊断技术的操作要求。 本标准适用于动物布鲁氏菌感染特异抗体的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 18646-2002 动物布鲁氏菌病诊断技术 GB 19489-2008 实验室 生物安全通
3、用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 布鲁氏菌病 Brucellosis 布鲁氏菌（Brucella）感染引起的急性或慢性人兽共患传染病，表现为流产，主要感染山羊、牛、 猪及绵羊等，可导致人发热出汗、肝脾肿大、骨关节炎、睾丸炎和心内膜炎。 4 试剂及仪器 4.1 试剂 流产布鲁氏菌光滑型脂多糖抗原包被的微量板 冻干单克隆抗体 辣根过氧化物酶标记交联物 20倍浓缩吐温磷酸盐缓冲液PBS-Tween 样本稀释缓冲液 底物溶液（含H 2O2的四甲基联苯胺底物缓冲液,避光！） 终止液（含硫酸） A 阳性对照血清 B 阴性对照血清 C 弱阳性对照血清 4.2 仪器 DB37/T
4、20322012 2 精密移液器（5-200L） 酶标仪，450nm 滤光片 5 检测方法（竞争酶联免疫吸附试验） 5.1 样品的采集和处理 被检动物血液采集及血清分离参照GB/T 18646-2002。 5.2 操作步骤 5.2.1 试验所有试剂回温到 18-25。 5.2.2 对照和样本的稀释 在微量板内直接稀释样本和对照：在微量板孔内加入45L 样本稀释缓冲液。 a) 加入 5L 血清对照。分别于适当孔内加入阳性对照、弱阳性对照和阴性对照。 b) 在 2 个适当的孔内（作为交联物对照控制，Cc）加入 5L样本稀释缓冲液。 c) 在每个待检孔内加入 5L 样本。为试验控制，建议样本设重复（
5、1 次）。 5.2.3 所有对照和样本孔内加入 50L 单抗溶液（加入时间差小于 10min）。 5.2.4 将微量板密封后于振荡器上震荡 5min 以充分混合。 5.2.5 室温（18-25）孵育 30min。 5.2.6 以 PBS-Tween 缓冲液洗涤微量板 4 次，每次洗涤各孔充满、空净、叩板。 5.2.7 每孔加入 100L 交联物溶液，将微量板密封后室温孵育 30min。 5.2.8 重复步骤 5.2.6。 5.2.9 每孔加入 100L 底物溶液，并在室温条件下孵育 10min。第一孔加入后开始计时。 5.2.10 每孔加入 50L 终止液，混合均匀，终止反应。终止液加入顺序同
6、上一步。 5.2.11 于酶标仪 450nm 读取对照和样本的光密度值（OD），以空气作为空白，应在加入终止液 15min 内读取。 6 结果判定 6.1 计算每一对照和样本的平均 OD 值。 6.2 按照下列公式计算对照和样本的百分抑制值（PI） PI=100-(平均OD 样本/对照 *100)/平均OD 交联物对照控制Cc 根据下列标准值范围确定本试验数据的有效性。 OD Cc 0.75-2.0 PI 阳性对照 85-110 PI 弱阳性对照 30-60 PI 阴性对照 -10-15 6.3 检测样本结果 试验有效条件下，根据下列范围确定所检测样本的结果。 PI值 结果 DB37/T 20322012 3 30% 阴性 30% 阳性 7 废弃物的处理和检测过程中安全措施 按照GB 19489-2008和 GB/T 18646-2002执行。 _
