1、 ICS 65.020.30 B40 备案号 山东省地方标准 DB37/T6032006 鸡肝中呋喃唑酮代谢物（A0Z）残留量 的测定-酶联免疫吸附法 Determination of furazolidone(AOZ) in chicken liver enzyme linked immunosorbent assay 200- - 发布 2006-07-01 实施 DB37 山东省质量技术监督局发布 DB37 /T6032006 I 前言 本标准由山东省畜牧办公室、山东省畜牧业标准化技术委员会提出。 本标准起草单位：山东省畜产品质量检测中心。 本标准主要起草人：高迎春、陈玲、冯修光、魏秀丽
2、。 DB37 /T6032006 1 鸡肝中呋喃唑酮代谢物（AOZ）残留量的测定 酶联免疫吸附法 1 范围 本标准规定了鸡肝中呋喃唑酮代谢物（AOZ）残留量的酶联免疫吸附测定方法。 本标准适用于鸡肝中呋喃唑酮代谢物（AOZ）的快速检测。本方法检测限为100ng/kg。该方法适合 于对试样的筛选，检测结果阳性者，需进一步用其他方法确证。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的 修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版
3、本适用于本标准。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 酶联板的微孔板包被有针对呋喃唑酮抗体的抗体，加入呋喃唑酮抗体，酶标记物，标准或样品溶液， 游离呋喃唑酮与酶标记物竞争呋喃唑酮抗体。同时呋喃唑酮抗体也与固定的羊抗体结合，通过洗涤除去 没有结合的酶标记物，将酶基质发色剂加入到孔中并且孵育，结合的酶标记物将无色的发色剂转化为 蓝色的产物，加入反应终止液后由蓝色转变为黄色，用酶标仪在450nm处测定吸收度，标准曲线计算。 4 材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂，水为蒸馏水，符合GB/T6682三级水的规定。 4.1 2硝基苯甲醛溶液c【（C 7H5NO3）】1mol/L。
4、4.2 二甲基亚砜（(CH 3)2SO） 4.3 乙酸乙酯（CH 3COOC2H5） 4.4 正己烷CH 3(CH2)4CH3 4.5 磷酸氢二钾溶液 c【（K 2HPO4）】0.1mol/L。 4.6 氢氧化钠溶液 c【（NaOH）】1mol/L。 4.7 盐酸溶液 c【（HCl）】1mol/L。 4.8 呋喃唑酮代谢物（AOZ）系列标准液 4.9 酶标记物 4.10 呋喃唑酮代谢物（AOZ）抗体液 4.11 基质发色剂 4.12 反应终止液 4.13 样品及洗涤缓冲液 5 .仪器 5.1 分析天平：感量 0.01g。 5.2 离心机 （5000r/min） 5.3 微量移液器：单道 1 L
5、100 L；多道 50 L250 L 5.4 均质器 5.5 振荡器 DB37 /T6032006 2 5.6 酶标板 5.7 酶标仪 6 测定步骤 使用不同品牌试剂盒时，试样的提取方法和测试程序可根据试剂盒说明书略作调整。 6.1 试料的提取 取鸡肝样品约30g,以10000r/min匀浆2min， 称取1g匀浆物 （精确至0.01g） ， 加入4mL的蒸馏水， 0.5mL 1molL的HCL（4.7）和100L10mm ol/L的2-硝基苯甲醛（4.1）（用二甲基亚砜溶解），充分振荡；在 37过夜孵育（大约16小时），分别加入5mL0.1mol/LK 2HPO4（4.5），0.4mL1mo
6、l/LNaOH（4.6）和5mL 的乙酸乙酯 （4.3） ， 剧烈振荡30秒钟。 在20-25以3000r/min离心10分钟。 取出2.5mL的乙酸乙酯 （4.3） 上层液到另一个新的容器中蒸干燥。用1mL的正己烷（4.4）溶解干燥物，用1mL的样品稀释液适当的混 合，在20-25以3000r/min离心10分钟。取50L的下层液体进行分析。 6.2 测试程序 6.2.1 取出酶标板（5.6）及所有试剂，使试剂盒温度升至室温。 6.2.2 分别吸取系列标准溶液（4.8）,空白试料溶液，试样溶液各 50L 到各自的微孔中。 6.2.3 加入 50L 酶标记物溶液（4.9）到每一个微孔底部，充分
7、混合。 6.2.4 加入 50L 抗体溶液（4.10）到每一个微孔底部充分混合，封口膜封板,室温孵育 60min。 6.2.5 倒出孔内液体,将酶标板（5.6）倒置在吸水纸上拍打,使孔内没有残余液体.用多道移液器加样 品洗涤缓冲液 250L 到酶标板（5.6）的微孔内,然后倒出孔内液体,如此重复操作三次。 6.2.6 加入 100L 基质/发色试剂（4.11）到每一微孔中，充分混合并在室温暗处孵育 15min。 6.2.7 用多道移液器每孔加终止液（4.12）100L。 6.2.8 将酶标板（5.6）放于酶标仪内,于 450nm 波长处测定吸光度值。 以零标准吸光度值A 0为100%计算，折算
8、出各标准和试样的相对吸光度值。以此吸光度百分比为纵坐 标，对应的各标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。待测样品根据其吸光度，查标准曲线得到盐酸克 伦特罗的含量（m 1）。 7 结果计算 试样中呋喃唑酮代谢物(AOZ)的含量（X）以 g/kg表示，按公式(1)计算 D m m X = 1 (1) 式中: m1从标准曲线上查得的试料提取液中呋喃唑酮代谢物(AOZ)的质量，单位为纳克（ng）； m试料质量，单位为克（g）； D稀释倍数。 以两次平行测定结果的算术平均值为测定结果。计算结果保留三位有效数字。 8 精密度 8.1 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的20%。
