1、 ICS65.120 B20 备案号： 山东省地方标准 DB37/T 5742005 饲料中地西泮快速筛选通则 酶联免疫吸附测定法 General Rule of Diazepan Screening in Feeds -Enzyme Linked Immunosorbent Assay 2005- 发布 2006-03-01 实施 DB37 山东省质量技术监督 局 发布 DB37/T5742005 I 前 言 本标准由山东省畜牧办公室、山东省畜牧业标准化技术委员会提出。 本标准起草单位：山东省饲料监察所。 本标准主要起草人：徐强、李会荣、孟凡胜、李俊玲、刘华阳。 DB37/T5742005
2、1 饲料中地西泮快速筛选通则 -酶联免疫吸附测定法 1 范围 本标准规定了用酶联免疫吸附法测定饲料中地西泮的方法。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料中地西泮的快速筛选。 本方法的最低定量限为1mg/kg。该方法适合于对试样的筛选，检测结果阳性者，需进一步用其他方 法确证。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的 修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GBT 6682 分析实验室用
3、水规格和试验方法 3 原理 利用物理方法将地西泮抗体吸附于固相载体表面，根据抗原抗体的特异性反应，加入标准或试料提 取液及酶标地西泮抗原（已知抗原）与抗体进行特异性的免疫竞争反应。未反应的酶标物在洗涤中被清 除，结合的酶标记物可以由显色物显示出来。显色的强弱与样品中的地西泮的量成反比。 4 试剂和 材料 除非另有说明，本标准所用试剂均由试剂盒厂商提供，水为蒸馏水，符合GB/T6682三级水的规定。 不同品牌试剂盒试剂组成略有差别。 4.1 酶标记的地西泮。 4.2 地西泮阳性、阴性对照品。 4.3 底物溶液。 4.4 甲醇溶液：80% 。 4.5 终止液。 4.6 滤纸。 4.7 吸水纸。 5
4、 仪器、设备 5.1 酶标板：48 孔或 96 孔； 5.2 粉碎机。 5.3 天平：感量 0.01g。 5.4 漩涡混合器。 5.5 离心机：转速000r/min 以上。 5.6 离心管：50mL 、1.5mL 。 DB37/T5742005 2 5.7 单道、多道微量加液器。 5.8 吸头。 5.9 酶标仪。 6 试样的制备 取饲料样品1000g，用四分法缩减分取200g左右，粉碎全部过0.45mm孔径筛，充分混匀，装入磨口 瓶中备用。 7 分析步骤 不同品牌的试剂盒其测定步骤略有差别，使用不同品牌试剂盒时，试样的提取方法和测试程序可根 据试剂盒说明书略作调整。 7.1 试样的提取 称取试
5、料5g（精确至0.01g）于50mL离心管中，加入10mL 甲醇溶液，于漩涡混合器上涡旋3min， 3000r/min离心5min 。移取适量上清液，用磷酸盐缓冲液稀释，使稀释后的样液处于检测范围内（不超 出标准曲线）。 7.2 测试程序 7.2.1 将所用酶标板及所有试剂从冰箱中取出，使试剂盒温度升至 20 24 o C。注意每种试剂使用前均需 摇匀。 7.2.2 将足够标准和试料所需数量的酶标板孔条插入微孔架，每个试样和标准需做 2 孔。 7.2.3 移取 10 L 制备好的试样溶液和标准溶液于各自的微孔中，再加入 100 L 酶结合物到每个微孔 中，并轻轻震荡使其充分混匀。避光处室温孵育
6、 60min 后，用双蒸水 300 L 重复洗板 6 次，最后于吸 水纸上拍干酶标扳。 7.2.4 每孔加入 100 L 底物溶液，并轻轻震荡使其充分混匀，在避光处室温孵育 30min。 7.2.5 每孔加入终止液 100 L，轻轻震荡混匀。微孔内液体的颜色由蓝色变为黄色。 7.2.6 用目测法对样品孔的颜色和限量孔进行比较或用酶标仪进行测定。 用酶标仪，在450nm条件下测定标准孔及试料孔吸光度值A，读板过程应在加入终止液后30min内完 成。以零标准吸光度值A 0为100%计算，折算出各标准和试样的相对吸光度值。以吸光度百分比为纵坐标， 对应的各标准溶液浓度为横坐标，在半对数坐标上绘制标准
7、曲线。根据试样吸光度，查标准曲线得到地 西泮的含量（m 1）。 7.3 结果判定 7.3.1 目测法： 如果试样孔颜色与阴性对照孔接近或更深，则判定该样品不含地西泮；如果试样孔比阴 性对照孔浅，比限量孔深，则判定该样品含有地西泮，但浓度低于限量；如果试样孔和阳性对照相同， 则判定该样品含有地西泮，且浓度等于限量；如果试样孔比阳性对照浅，则判定该样品含有地西泮且浓 度高于限量。 7.3.2 酶标仪法： 测定结果低于限量孔，地西泮含量合格；测定结果等于或大于限量孔，地西泮含量 超标，不合格。 8 结果计算与表述 8.1 计算公式 试样中地西泮的含量（X）以 g/kg表示，按公式(1)计算 D m m X = 1 (1) DB37/T5742005 3 式中: m1从标准曲线上查得的试料提取液中的地西泮的质量，单位为纳克，ng ； m 试样质量，单位为克，g； D稀释倍数。 8.2 以两次平行测定的算术平均值为测定结果，计算结果保留三位有效数字。 9 精密度 9.1 重复性 在同一实验室，两次独立测定结果的相对偏差不大于 20%。 9.2 再现性 在不同实验室，两次独立测定结果的相对偏差不大于40%。
