1、ICS 11.220 B 41 DB37 山东省 地方标准 DB37/T 4047 2020 猪圆环病毒 3 型聚合酶链式反应检测方法 Detecting porcine circovirus 3 with polymerase chain reaction 2020 - 07 - 09 发布 2020 - 08 - 09 实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 4047 2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。
2、 本标准主要起草人：李俊、时建立、彭喆、徐绍建、吴晓燕、刘畅、李琛、孙文博、于江、丛晓燕、 韩红、吴家强、杜以军、陈智。 DB37/T 4047 2020 1 猪圆环病毒 3 型聚 合酶链式反应检测方法 1 范围 本标准规定了猪圆环病毒 3型（ Porcine Circovirus Type 3， PCV3）的聚合酶链反应（ Polymerase Chain Reaction， PCR）试验方法。 本标准适用于猪圆环病毒 3型的快速诊断、检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包
3、括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 541 2016 兽医诊 断样品采集、保存与运输技术规范 3 原理 聚合酶链反应或多聚酶链反应（ Polymerase Chain Reaction， PCR），又称无细胞克隆技术，是一 种对特定的 DNA片段在体外进行快速扩增的方法。 PCR由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA链互补的半 保留复制链，重复循环变性 -退火 -延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，经过 25 30个循环 后，理论上可
4、使基因扩增 109倍以上。每完成一个循环需 2 min 4 min， 2 h 3 h就能将待扩目的基因 扩增放大几百万倍。 4 试剂和材料 4.1 水： GB/T 6682，一级水。 4.2 蛋白酶 K 溶液（ 20 mg/mL）：配制见附录 A.1。 4.3 10 %十二烷基硫酸钠（ SDS 溶液， pH7.2）：配制见附录 A.2。 4.4 Tris 平衡酚。 4.5 三氯甲烷。 4.6 无水乙醇。 4.7 70 %乙醇：配制见附录 A.3。 4.8 0.5 TBE 缓冲液：配制见附录 A.4。 4.9 电泳级 1 %琼脂糖：配制见附录 A.5。 4.10 DNA 核酸染料。 4.11 D
5、NA Marker 2000。 4.12 引物： P1： 5 -TACCACAGAAGGCGCTATGTCG-3； DB37/T 4047 2020 2 P2： 5 -ATCCGCATAAGGGTCGTCTTGC-3。 5 仪器设备 5.1 电子天平：感量为 0.001 g。 5.2 微量移液器（最大量程分别为 10 L、 20 L、 100 L、 1 000 L）。 5.3 低温高速离心机。 5.4 PCR 仪。 5.5 稳流稳压电泳仪。 5.6 水平电泳槽。 5.7 凝胶成像系统。 6 样品 6.1 样品采集 按 NY/T 541 2016无菌采集血清或猪淋巴结、肝脏、肺脏、脾脏和肾脏等器
6、官组织。 6.2 样品处理 6.2.1 血清直接用于 DNA 提 取。 6.2.2 淋巴结、肝脏、肺脏、脾脏和肾脏等器官组织各 1 g 剪碎放于灭菌的研磨器中磨碎，用生理盐 水 1:5 倍稀 释，取悬液反复冻融 3 次， 5 000 g 离心 15 min，取上清液 -20 保存备用。 7 操作步骤 7.1 病毒 DNA 的提取 7.1.1 取上清液（或血清） 500 L 加入 10 %SDS 溶液 50 L、 20 mg/mL 蛋白酶 K 溶液 10 L，于 55 水浴 2 h 3 h。 7.1.2 加入 200 L Tris 平衡酚，混匀， 4 12 000 g 离心 15 min 7.1
7、.3 取上清液 500 L，加入 200 L Tris 平衡酚和 200 L 三氯甲烷， 4 12 000 g 离心 15 min。 7.1.4 取上清液 400 L，加入 200 L 三氯甲烷， 4 12 000 g 离心 15 min。 7.1.5 取上清液 300 L，加入 2 倍体积的无水乙醇， -20 静置 20 min， 4 12 000 g 离心 15 min。 7.1.6 弃上清液，加入 1 mL 70 %的乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。 7.1.7 加入 20 L 灭菌一级水溶解沉淀， -20 保存备用。 7.2 聚合酶链式反应（ PCR）操作流程 7.2.1 PCR
8、 反应体系配制 按表 1中 1-7的循序配制。 表 1 聚合酶链式反应体系 1 10 反应缓冲液 5.0 L 2 dNTP 混合液 (10 mmol/L) 4.0 L DB37/T 4047 2020 3 表 1 聚合酶链式反应体系 （续） 3 P1(10 mol/L) 1.0 L 4 P2(10 mol/L) 1.0 L 5 DNA 4.0 L 6 TaqDNA 聚合酶 (8 U/L ) 1.0 L 7 灭菌水 补足至总体积 50.0 L 7.2.2 PCR 程序设定 每次 PCR均应设一个阳性对照和阴性对照（用灭菌水作为模板），具体参数见表 2。 表 2 PCR 反应程序设定 温度 时间
9、1 94 4 min 2 94 20 s 3 50 30 s 4 72 1 min 5 重复步骤 2 4 40 个循环 6 72 5 min 7.3 电泳操作 电压 100 V电泳 40 min，并在凝胶中加入 DNA核酸染料，在 DNA凝胶成像系统仪下观察并拍照。 8 结果分析和判定 电泳反应结束后，如果阳性对照孔出现 330 bp大小条带，阴性对照孔无特异性条带，则试验成立。 在试验成立的条件下，若泳道扩增出大小为 330 bp片段判为疑似阳性样品（说明样品中疑似含有猪 圆环病毒 3型），将目的条带进行序列测定，经序列分析后确认为阳性样品（说明样品中含有猪圆环病 毒 3型），无特异性扩增的
10、泳道判为阴性。 9 试验材料处理 9.1 病料的无害化处理 对确诊为 PCV3阳 性的病料应采取深埋、焚烧等方法对病料进行无害化处理。 9.2 试验材料处理 对于 PCR过程的废弃物应放置于专门处置危险废弃物的容器内，通过高压消毒等处理后达到生物学 安全标准后才能运出实验室处理。 DB37/T 4047 2020 4 A A 附 录 A （规范性附录） 试剂的配制 A.1 蛋白酶 K溶液 (20 mg/mL) 蛋白酶 K 100 mg 灭菌一级水 5 mL A.2 10 %十二烷基硫酸钠 (SDS溶液， pH7.2) 十二烷基硫酸钠 10 g 灭菌一级水 80 mL 浓盐酸 调 pH至 7.2 灭菌一级水 加至 100 mL A.3 70 %乙醇 无水乙醇 70 mL 灭菌一级水 30 mL A.4 0.5 TBE缓冲液 Tris 108 g Na2EDTA.2H2O 7.44 g 硼酸 55 g 灭菌一级水 1 L，配 成 10 TBE缓冲液 取 10 TBE缓冲液 25 mL，加灭菌一级水 475 mL，制成 0.5倍的工作液。 A.5 电泳级 1 %琼脂糖 琼脂糖 0.6 g 0.5 TBE缓冲液 60 mL _
