1、 ICS 65.120 B20 备案号 山东省地方标准 DB37/T5762005 饲料中盐酸克伦特罗快速筛选通则 酶联免疫吸附测定法 General Rule of Clenbuterol Screening in Feeds -Enzyme Linked Immunosorbent Assay 2005- 发布 2006-03-01 实施 DB37 山东省质量技术监督局 发布 DB37 /T5762005 I 前 言 本标准由山东省畜牧办公室、山东省畜牧业标准化技术委员会提出。 本标准负责起草单位：山东省饲料监察所。 本标准参加起草单位：北京望尔生物技术有限公司、无锡微生物研究所。 本标准
2、主要起草人：李俊玲、宫玲玲、强莉、李会荣、万宇平、王琳。 DB37 /T5762005 1 饲料中盐酸克伦特罗快速筛选通则 -酶联免疫吸附测定法 1 范围 本标准规定了用酶联免疫吸附法测定饲料中盐酸克伦特罗的方法。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料及添加剂预混合饲料中盐酸克伦特罗的快速筛选。本方法最低定 量限为10 g/kg。该方法适合于对试样的筛选，检测结果阳性者，需进一步用其他方法确证。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的 修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可
3、使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 方法原理 利用物理方法将盐酸克伦特罗抗体吸附于固相载体表面，根据抗原抗体的特异性反应，加入标准或 试料提取液及酶标盐酸克伦特罗抗原（已知抗原）与抗体进行特异性的免疫竞争反应。未反应的酶标物 在洗涤中被清除，结合的酶标记物可以由显色物显示出来。显色的强弱与样品中的盐酸克伦特罗的量成 反比。 4 试剂和溶液 除非另有说明，本标准所用试剂均由试剂盒厂商提供，水为蒸馏水，符合GB/T6682三级水的规定。 不同品牌试剂盒试剂组成略有差别。 4.1 盐酸克伦特罗系列标准溶液。 4
4、.2 抗盐酸克伦特罗的特异性抗体。 4.3 酶标记抗原。 4.4 显色剂。 4.5 浓缩洗涤液。 4.6 底物缓冲溶液。 4.7 终止液。 4.8 盐酸溶液，c（HCl）1mol/L。 4.9 氧化钠溶液，c（NaOH）1mol/L。 5 仪器设备 5.1 分析天平：感量 0.01g。 5.2 酶标板。 5.3 离心机：2000r/min 以上。 5.4 微量移液器：单道 1100 L；多道 50250 L。 DB37 /T576200 2 5.5 振荡器。 5.6 漩涡振荡器。 5.7 酶标仪。 5.8 恒温箱。 6 试样的制备 取饲料样品1000g，用四分法缩减分取200g左右，粉碎全部过
5、0.45mm孔径筛，充分混匀，装入磨口 瓶中备用。 7 测定步骤 不同品牌的试剂盒其测定步骤略有差别，使用不同品牌试剂盒时，试样的提取方法和测试程序可根 据试剂盒说明书略作调整。 7.1 试料的提取 称取 2g 试样（精确至 0.01g），加入 2mL 1mol/L 盐酸，16mL 水后摇均。涡旋 3min，于振荡器上 震荡 15min。2000r/min 离心 20min，转移上清液并加入 2mL 1mol/L 氢氧化钠于上清液中混匀，使 pH 在 6.57.5 之间。 2000r/min 离心 20min， 转移出上清液（如果上清仍然混浊可提高转速或用滤纸过滤）。 用水稀释 50 倍，并混
6、合均匀。取 20L 进行分析。此时样品的稀释倍数为 500 倍。 7.2 测试程序 7.2.1 将所用酶标板及所有试剂从冰箱中取出，使试剂盒温度升至 20 24 o C。注意每种液体试剂使用 前均需摇匀。 7.2.2 将足够标准和试样所用数量的孔条插入微孔架，每个试样和标准需做 2 孔。 7.2.3 加入 20L 的试样和标准于各自的微孔中，每孔再加入 80L 盐酸克伦特罗抗体溶液。 7.2.4 将微孔架置于 37 o C恒温箱中孵育 30min后用工作洗涤液洗板，最后用吸水纸拍干。 7.2.5 每孔加入 100L酶标记的二抗溶液，在 37 o C孵育 30min后用工作洗涤液洗板，最后用吸水
7、纸拍 干。 7.2.6 每孔加入显色剂 100L，轻轻震荡混匀，37 o C避光显色 15min。 7.2.7 每孔加入终止液 50L，轻轻震荡混匀。 7.2.8 用目测法对样品孔的颜色和限量孔进行比较或用酶标仪进行测定。 用酶标仪测定时，以零标准吸光度值A 0为100%计算，折算出各标准和试样的相对吸光度值。以此吸 光度百分比为纵坐标，对应的各标准溶液浓度为横坐标，在半对数坐标上绘制标准曲线。该定标模型在 2002000ng/L范围内是线性关系。 待测样品根据其吸光度，查标准曲线得到盐酸克伦特罗的含量（m 1）。 7.3 结果判定 7.3.1 目测法： 如果待测样品的颜色与阴性对照孔接近或更
8、深，则判定该样品不含盐酸克伦特罗；如 果待测样品比阴性对照孔浅，比限量孔深，则判定该样品含有盐酸克伦特罗，但浓度低于限量；如果待 测样品和阳性对照相同，则判定该样品含有盐酸克伦特罗，且浓度等于限量；如果待测样品比阳性对照 浅，则判定该样品含有盐酸克伦特罗且浓度高于限量。 7.3.2 酶标仪法：在 450nm 处，用空气做参比调零点，然后测定标准孔及试料吸光度值 A。 8 结果计算 8.1 计算公式 试样中盐酸克伦特罗的含量（X）以 g/kg表示，按公式(1)计算 DB37 /T5762005 3 D m m X = 1 (1) 式中: m1从标准曲线上查得的试料提取液中的盐酸克伦特罗的质量，单位为纳克，ng； m 试料质量，单位为克，g； D稀释倍数。 8.2 以两次平行测定结果的算术平均值为测定结果。计算结果保留三位有效数字。 9 精密度 9.1 重复性 在同一实验室，两次独立测定结果的相对偏差不大于20%。 9.2 再现性 在不同实验室，两次独立测定结果的相对偏差不大于40%。
