1、 ICS 65.120 B20 山东省地方标准 DB37/T 5772005 饲料添加剂 6 位点植酸酶活性的测定 分光光度法 Determination of feed additive 6-phytase activity- Spectrothotometric method 2005- 发布 2006-03-01 实施 DB37 山东省质量技术监督局 发布 DB37/T5772005 I 前 言 附录A、附录B为资料性附录。 本标准由山东省畜牧办公室、山东省畜牧业标准化技术委员会提出。 本标准负责起草单位：山东省饲料监察所。 参加起草单位：济南天天香饲料有限公司。 本标准主要起草人：李俊
2、玲、孙延军、郭芳坤、韩冰、战余铭、门晓东。 DB37/T 5772005 2 饲料添加剂 6 位点植酸酶活性的测定 分光光度法 1 范围 本标准规定了以分光光度法测定饲料添加剂 6位点植酸酶活性的方法。 本标准适用于作为饲料添加剂使用的6位点植酸酶产品。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的 修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 3 定义 6位点植酸酶活性单位：样品在植酸钠浓度为5.0 mmo
3、lL、温度37、pH值5.00的条件下，每分钟 从植酸钠中释放1 mol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。 4 方法原理 6位点植酸酶在一定温度和pH条件下，水解底物植酸钠，生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性溶液中， 与钒钼酸铵反应生成黄色的(NH 4)3PO4NH4VO316MoO3复合物，在波长415nm下进行比色测定。 5 试剂和溶液 本标准中所用试剂，均为分析纯试剂，水为符合GBT 6682 中规定的三级水。 所用器皿洗涤不要用含磷清洗剂。 5.1 硝酸。 5.2 氨水。 5.3 冰醋酸。 5.4 Tritonx-100。 5.5 肌醇六磷酸钠(C 6H6O24P6Na12)。 5
4、.6 钼酸铵(NH 4)6Mo7O244H 2O。 5.7 三水乙酸钠。 5.8 偏钒酸铵(NH 4VO3)。 5.9 牛血清蛋白（BSA）。 5.10 磷酸二氢钾(KH 2PO4)：基准试剂。 5.11 乙酸缓冲液(I)，0.25molL：称取 34.02g 三水乙酸钠（5.7）于 1000mL 容量瓶中，加入 900mL 水溶解，用冰醋酸（5.3）调节 pH 至 5.00 0.01，并用蒸馏水定容至 1000mL 。室温下有效期 2 个月。 5.12 乙酸缓冲液()，0.25molL：称取 34.02g 三水乙酸钠（ 5.7）、0.5gTritonX-100（5.4）、0.5g 牛血清白蛋
5、白（BSA） （5.9）于 1000mL 容量瓶中，加入 900mL 水溶解，用冰醋酸（5.3）调节 pH 至 5.00 0.01，并用蒸馏水定容至 1000mL。室温下有效期 2 个月。 DB37/T5772005 3 5.13 植酸钠溶液，7.5mmol/L：称取 0.6929g肌醇六磷酸钠(C 6H6O24P6Na12)（5.5）于 100mL容量瓶中， 用 0.25molL乙酸缓冲液(5.11)溶解并定容至刻度。用冰醋酸（5.3）调节pH至 5.000.01，现用现配。 5.14 硝酸溶液：1+2 水溶液。 5.15 钼酸铵溶液， 100gL： 称取 10g钼酸铵(NH 4)6Mo7O
6、244H 2O（5.6） 于 100mL容量瓶中， 加入 1.0mL 氨水（5.2），用水溶解并定容至刻度。 5.16 偏钒酸铵溶液，2.35 gL：称取 0.235 g偏钒酸铵(NH 4VO3)（5.8）于 100mL棕色容量瓶中，加入 2 mL硝酸溶液(5.14)，用水溶解定容至刻度。避光条件下保存，一周内有效。 5.17 颜色终止液：移取 2 份硝酸溶液(5.14)，1 份钼酸铵溶液(5.15)，1 份偏钒酸铵溶液(5. 16)混合 后使用，现用现配。 5.18 磷标准液：准确称取 0.6804g 在 105烘至恒重的基准磷酸二氢钾( 5.10)于 100mL 容量瓶中，用 乙酸缓冲液(
7、5.12)溶解，并定容至 100mL。此浓度为 50.0molmL。 6 仪器设备 6.1 电子天平：感量 0.1mg。 6.2 恒温水浴：370.1。 6.3 分光光度计：附 10mm 比色皿。 6.4 磁力搅拌器。 6.5 漩涡混合器。 6.6 酸度计：精度0.01pH。 6.7 离心机：转速为 4000rmin 以上。 6.8 温度计：精度为0.1，最大量程 50。 7 试样制备 取有代表性样品，用四分法将试样缩分至200g左右，装入密封容器。 8 测定步骤 8.1 标准系列的制备： 吸取磷标准液（5.18）0.5ml，用乙酸缓冲液(5.12)分别稀释至 1.0、2.0、4.0、8.0、
8、16.0ml，混 匀。上述标准工作液的浓度分别为25.0、12.5、6.25、 3.125、1.562mol/mL。 8.2 试样溶液的制备 参照附录A中建议的称样量称取试样两份，精确至0.1mg，置于100 mL烧杯中，加入约70mL乙酸缓冲 液(5.12)，在磁力搅拌器(6.4)上搅拌30min，用乙酸 缓冲液(5.12)定容至100mL。 摇匀，静置，取约10mL 上清液，在离心机(6.7)上4 000rmin离心1 0min。移取适量上清液用乙酸缓冲液(5.12)稀释，使样液 浓度保持在0.4UmL左右。 8.3 反应 取10mL试管按下面的反应顺序进行操作，在反应过程中，从加入底物(
9、5.13)开始，向每支试管中加 入试剂的时间间隔要一致。37水解30min。 反应步骤及试剂、溶液用量见表1。 表1 DB37/T 5772005 4 反应顺序 试料（ml） 标准（ml） 试料空白（ml） 标准空白（ml） 1.加乙酸缓冲液(5.1) 1.8 1.8 1.8 2.0 2.加入待反应液 0.2 0.2 0.2 3.混合 4.37预热 5 min 5.依次加入底物(5.3) 4 4 4 (第二步) 6.混合 7.37水解 30min 8.依次加入终止液(5.7) 4 4 4(第一步) 9.混合 总体积 10 10 10 注：“ ”是按要求操作，“”不操作。 8.4 样品测定 反应
10、后的试料溶液在室温下静置10min， 如出现混浊， 需在离心机(6.7)上以4 000r min离心10min。 取上清夜，以蒸馏水调零，在分光光度计(6.3)415 nm 处测定吸光值。同时做标准曲线。 9 结果计算 9.1 计算公式 试样中6位点植酸酶的活性,用每克试样中的活性单位“U ”表示, 计算公式如下： X D m c 30 (1) 式中： X试样中6位点植酸酶的活性，Ug； C根据样液的实测吸光值由直线回归方程计算出的酶活性，U； D试样溶液反应前的总稀释倍数； m试样质量为克，g； 30反应时间为分钟，min。 9.2 结果表示 以两次平行测定结果的算术平均值为测定结果。保留三位有效数字。 10 精密度 10.1 重复性 同一实验室两次独立测定结果的相对偏差不大于20%。 10.2 再现性 不同实验室间两次独立测定结果的相对偏差不大于40%。
