1、ICS 62.020.01 B 05 DB37 山东省 地方标准 DB37/T 3995 2020 松花粉多糖实验室提取技术规程 Technical specification for laboratory extraction of pine pollen polysaccharides 2020-06-08 发布 2020-07-08 实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 3995 2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东农业大学、山东省
2、动物疫病预防与控制中心。 本标准主要起草人：朱瑞良、魏凯、黄河、胡莉萍、杨萍萍、楚遵锋、刘宴博、崔莉、汪洋、徐启 杰、陈峰。 DB37/T 3995 2020 1 松花粉多糖实验室提取技术规程 1 范围 本标准规定了松花粉中松花粉多糖的实验室提取及测定方法。 本标准适用于松花粉中松花粉多糖的提取和测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 试剂或材料 除非另有规定，所用试剂均为分析纯。 3.1 水
3、：符合 GB/T 6682 的规定的三级水。 3.2 乙醚。 3.3 胃蛋白酶。 3.4 Sevag 试剂，配制方法见附录 A。 3.5 无水乙醇。 3.6 磷酸盐缓冲溶液（ PBS），配制方法见附录 A。 3.7 葡萄糖对照品，纯度 99%。 3.8 浓硫酸。 3.9 苯酚。 4 仪器设备 4.1 260 目筛网。 4.2 恒温干燥箱。 4.3 超微粉碎机。 4.4 电子天平：精度 0.001 g。 4.5 索氏提取器。 4.6 水浴锅。 4.7 高速离心机：转速不小于 16000 r/min。 4.8 旋转蒸发仪。 4.9 真空干燥器。 4.10 移液器： 10 L 1000 L。 4.1
4、1 振荡器。 DB37/T 3995 2020 2 4.12 分光光度计：波长范围 380 nm 780 nm。 4.13 pH 计。 5 松花粉的准备 于每年四、五月份采集松树的花粉，过 260目筛网筛除杂质，放入恒温干燥箱中于 70 烘干，用超 微粉碎机破壁。 6 泰山松花粉多糖的提取 6.1 除脂 破壁松花粉用脱脂滤纸分装成 20 g独立小包，置于索氏提取器中，用乙醚回流抽提脂肪 4 h，将除 脂后的松花粉收集到烧杯中。 6.2 浸提 将除脂的松花粉与去离子水按 1:10比例置于 1000 mL烧杯中混合均匀，并加入 0.3%的胃蛋白酶。将 烧杯置于恒温水浴锅中，于 50 让松花粉与胃蛋
5、白酶充分反应 2 h，然后在 85 浸提 8 h使多糖充分溶 出。浸提过程中随时添加去离子水补充蒸发的水分，每 30 min搅拌 1次。浸提完置于 4 冰箱过夜沉淀。 6.3 过滤 将浸提液用四层纱布过滤去掉杂质，然后将上清用离心机在 8000 rpm条件下离心 10 min，得上清， 分装到 1000 mL量程的烧杯中。 6.4 浓缩 将得到的上清液用真空旋转蒸发器浓缩至 1/4体积； 6.5 除蛋白 沙 维积（ Sevag）试剂（附录 A）与浓缩液 1:5混合后置于振荡器上在 250 rpm 300 rpm条件下震荡 30 min，再在 5000 rpm 8000 rpm条件下震荡 15
6、min，然后用高速离心机在 10000 rpm条件下离心，弃 掉下层溶液和中间蛋白层，保留上层多糖溶液。该步骤重复 2次以上。 6.6 沉淀多糖 将除蛋白后的多糖溶液缓慢加入到四倍量无水乙醇中，置于 -20 冰箱让多糖沉淀过夜，弃上清， 保留多糖沉淀于烧杯中。 6.7 干燥 多糖经真空干燥器干燥后得精制松花粉多糖（待测多糖）。 7 多糖含量测定 7.1 标准曲线的制作 DB37/T 3995 2020 3 取 8支干净的带塞试管，按表 1方法分别加入相应体积的葡萄糖对照品溶液（附录 A），然后在冰水 浴中加入 0.5 mL的 6%苯酚溶液（附录 A），震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸，以不放热或微
7、量放热为宜， 摇匀后恒温加塞，沸水中放置 20 min，取出后用凉水冷却 10 min，以 0号作为空白调零，在最大吸收波 长处（ 490 nm）测定吸光度。以葡萄糖浓度 X为横坐标（ g/mL），吸光度 Y为纵坐标，绘制曲线，即为 标准曲线。用 Excel软件求得回归方程。 表 1 标准曲线的制作的试剂配制方法 管号 0 1 2 3 4 5 6 7 葡萄糖 （ mL） 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 苯酚液 （ mL） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 浓硫酸 （ mL） 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3
8、.0 7.2 结果计算 将提取得到的干燥精致松花粉多糖用水溶解，定容至 100 mL，取溶解后的溶液，按标准曲线中的测 定方法，以葡萄糖溶液为参比液，测定溶液的吸光值，按回归方程计算待测溶液的多糖浓度，注意乘以 换算系数，既得待测多糖含量。 7.3 结果判定 用苯酚 -硫酸法测的多糖含量大于 80%以上，视为合格品。 DB37/T 3995 2020 4 A A 附 录 A （规范性附录） 溶液的配制 A.1 Sevag试剂的配制 氯仿正丁醇 5+1。 A.2 磷酸盐缓冲溶液（ PBS）的配制 称取 NaCl 8.00 g， KCl 0.20 g， Na2HPO4 12H2O 3.36 g，
9、KH2PO4 0.24 g混合，溶于 1000 mL的水中， 混匀，测 pH值应在 7.2 7.4之间，若偏离此范围，用 0.1 mol/L的 HCl或 NaOH调整。 A.3 葡萄糖对照品溶液配制 称取葡萄糖 100 mg，水定容至 100 mL，配制成 1 mg/mL的葡萄糖液，摇匀后吸取 10 mL该溶液，用水 稀释定容至 100 mL，即得 100 g/mL的葡萄糖对照品溶液。 A.4 90%苯酚液的配制 量取苯酚 90 mL，用水定容至 100 mL，即得 90%苯酚液，棕色瓶中避光保存。 A.5 6%苯酚液的配制 将 90%苯酚液稀释至 6%，即 1体积 90%苯酚液对应 14体积水，现用现配。 _
