1、ICS 11.220 B 41 DB37 山东省 地方标准 DB37/T 4053 2020 新城疫病毒基因 VII 型荧光 定量 PCR 检测方法 Real-time PCR assay for the detection of genotype VII newcastle disease virus 2020 - 07 - 09 发布 2020 - 08 - 09 实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 4053 2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准
2、起草单位：山东省农业科学家禽研究所。 本标准主要起草人：孟凯、吴家强、宋敏训、袁小远、张玉霞、杨金兴、艾武、王友令、亓丽红。 DB37/T 4053 2020 1 新城疫病毒基因 VII 型荧光定量 PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了新城疫病毒基因 VII型（ NDV）荧光定量 PCR检测方法。 本标准适用于鸡咽喉和泄殖腔拭子及脑、肺脏、脾脏等组织中新城疫病毒基因 VII型的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实
3、验室用水规格和试验方法 3 试验原理 实时荧光定量 PCR检测是在 PCR反应体系中，除采用特异的引物外，还加入了与 DNA双 链非特异性结 合的 SYBR Green I荧光染料。当它与 DNA双链结合时，发出荧光，从 DNA双链上释放出来时，荧光信号急 剧减弱。随着 PCR反应的进行，每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变 化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。 4 试剂或材料 除非另有说明，在分析中仅使用分析纯的试剂，水为 GB/T 6682规定的一级水。 4.1 10磷酸盐缓冲液 PBS： pH 值 7.2。 4.2 研钵。 4.3 病毒 RNA提取试剂
4、盒。 4.4 SYBR Green I RT-PCR 缓冲液。 4.5 酶混合物：内含 MLV反转录 酶和 RNase Inhibitor。 4.6 DNA聚合酶。 4.7 阳性对照：浓度为 1.0 105拷贝 / L的阳性质粒。 4.8 阴性对照：水。 4.9 DEPC水。 5 仪器设备 5.1 微量可调移液器：最大量程为 10 L、 20 L、 100 L、 1 000 L。 5.2 台式高速冷冻离心机：最高转速 16 000 r/min。 5.3 荧光定量 PCR仪：温度范围 4.0 99.9 。 5.4 分析天平：精度为 0.01 g。 DB37/T 4053 2020 2 5.5 冰
5、箱：规格为 4 和 -20 。 5.6 二级生物安全柜。 6 引物 Forward Primer： 5 - CAYGTCYGGAGGAAGGAGRCARAA-3 Reverse Primer： 5 -GGATGTTGRCRGCATTCTKKT-3 注： Y=C或 T； R=A或 G； K=G或 T 7 样品 7.1 采集工具 棉拭子，剪刀，镊子， 1.5 mL离心管。 7.2 样品采集 7.2.1 咽喉拭子 /泄殖腔拭子 7.2.1.1 咽喉拭子采样：将棉拭子深入喉头来回刮 3次，取咽喉分泌液，放于含抗生素（青霉素 2 000 U/mL+链霉素 2 mg/mL）的 10磷酸盐缓冲液 PBS（
6、pH 值 7.2）的 1.5 mL离心管中。 7.2.1.2 泄殖腔拭子采样：将棉拭子深入泄殖腔转一圈沾取粪便（需有可见粪便），放于含抗生素（青 霉素 10 000 U/mL+链霉素 10 mg/mL）的 PBS中。 7.2.2 组织样品 待检禽无菌采集脑、肺脏、脾脏等组织，装入一次性采样袋或其他灭菌容器，编号。 7.3 样品运输与保存 样品放于保温箱中加冰，密封， 24 h内送至实验室，如不能立即检测，需将样品放于 -20 冰箱保 存。 7.4 样品处理 7.4.1 咽喉拭子 /泄殖腔拭子 将装有咽喉拭子 /泄殖腔拭子的 1.5 mL离心管在振荡器上充分混合后，取出棉拭子， 4 条件下 5
7、000 r/min离心 10 min，取上清液转入新的 1.5 mL离心管中，编号备用。 7.4.2 组织样品 将组织置于灭菌的研钵中，按照质量体积比（ 1:5 10）加入灭菌 PBS进行充分研磨， 4 条件下 5 000 r/min离心 10 min，取上清液转入新的 1.5 mL离心管中，编号备用。 8 试验步骤 8.1 病毒 RNA 提取 DB37/T 4053 2020 3 提取 RNA时应避免 RNA酶污染。同时设立阳性对照和阴性对照。用病毒 RNA提取试剂盒，按照说明书 步骤提取待检样品 RNA， -80 保存备用。 8.2 荧光定量 PCR 反应体系 详见表 1。 表 1 荧光定
8、量 PCR 反应体系 试剂 使用量 酶混合物 * 0.4 L DNA聚合酶 0.4 L SYBR Green I RT-PCR Buffer* 10 L PCR Forward Primer (10 mol/L) 0.4 L PCR Reverse Primer (10 mol/L) 0.4 L Total RNA 2.0 L DEPC水 6.4 L Total 20 L 每次均应设阴性对照。 *内含 MLV反转录酶和 RNA酶抑制剂。 *内含 dNTP Mixture， Mg2+，荧光染料 SYBR Green。 8.3 荧光定量 PCR 反应程序设定 详见表 2。 表 2 荧光定量 PCR
9、 反应程序设定 阶段 1：反转录反应 阶段 2： PCR 反应 阶段 3：溶解曲线分析 42 ， 15 min 95 ， 5 sec 95 ， 5 sec 95 ， 10 sec 60 ， 45 sec（收集荧光） 65 ， 5 sec 1 Cycle 40 Cycle 95 ， 5 sec 9 结果判定 9.1 结果分析条件设定 阈值设定原则：根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点为准。 9.2 试验成立条件 9.2.1 阴性对照无 Ct（或 Cp）值并且无扩增曲线。（参见附录 A.1） 9.2.2 阳性对照 Ct（或 Cp）值 35，并出现特定扩增曲线。（参见附
10、录 A.2） 9.2.3 如阴性和阳性对照不满足以上条件，此 试验视为无效。 9.3 结果描述及判定 9.3.1 阴性 DB37/T 4053 2020 4 无 Ct（或 Cp）值并且无扩增曲线，表明样品中无基因 VII型新城疫病毒核酸。 9.3.2 阳性 Ct（或 Cp）值 35，且出现特定扩增曲线， Tm值为 83.5 ，表明样品中存在基因 VII型新城疫病毒 核酸。（参见附录 A.3） 9.3.3 有效原则 Ct（或 Cp）值 35的样品须复检，重做结果无 Ct值者为阴性，否则为阳性。 DB37/T 4053 2020 5 A A 附 录 A （资料性附录） 荧光定量标准曲线参考图 阴性曲线图见图 A.1。 图 A.1 阴性曲线图 阳性曲线图见图 A.2。 图 A.2 阳性曲线图 DB37/T 4053 2020 6 溶解曲线图见图 A.3。 图 A.3 溶解曲线图 _
