1、ICS 65.060.25 B 10/14 DB37 山东省 地方标准 DB37/T 4049 2020 种鸡鸡毒支原体和滑液囊支原体病净化技 术规范 Technical criterion for eradication of mycoplasma gallisepticum and mycoplasma synoviae in breeder flock 2020 - 07 - 09 发布 2020 - 08 - 09 实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 4049 2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实
2、施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院家禽研究所、山东省健牧生物药业有限公司、五莲县畜牧兽医 管理服务中心。 本标准主要起草人：徐怀英、秦卓明、黄迪海、徐宁、亓丽红、井庆川、杨金兴、高月花、曹顶国、 宋玲玲、刘涛。 DB37/T 4049 2020 1 种鸡鸡毒支原体和滑液囊支原体病净化技术规范 1 范围 本标准规定了种鸡群鸡毒支原体和滑液囊支原体病净化技术规范。 本标准适用于曾祖代、祖代及非免疫父母代种鸡群鸡毒支原体和滑液囊支原体病的净化。本标准不 适用于疫苗免疫鸡场。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件
3、，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 17999.4 SPF 鸡微生物学监测 第 4部分： SPF鸡 血清平板凝集试验 NY/T 553 禽支原体 PCR检测方法 NY/T 1168 畜禽粪便无害化处理技术规范 NY/T 5030 无公害农产品兽药使用准则 DB34/T 2160 鸡毒支原体感染防治技术 DB63/T 1652 病害动物及病害动物产品无害化处理技术规程 T/CVMA 1 禽白血病净化技术规范 世界动物卫生组织（ OIE）陆生动物诊断试验和疫苗标准手册
4、3 术语与定义 下列术语和 定义适用于本文件。 3.1 种鸡 breeding chicken 按照动物育种四系配套的原则，将鸡的遗传谱系分为曾祖代、祖代、父母代和商品代，只有曾祖代 的鸡（原种鸡）可以自繁、自养和留种，而其他后代均必须按照四系配套的原则进行育种，且不能留做 和它同级的种。种鸡（祖代和父母代）是经过不断地选种和选育，具有一定的生产、生长和遗传稳定性， 能够提供子代，且按照育种组织制订的标准验收和鉴定并承认的鸡品种。按经济用途分为蛋用型、肉用 型、肉蛋兼用型和观赏型。 3.2 家禽疫病净化 poultry disease eradication 在一个养禽场或指定的养殖区域内，通
5、过持续不断的检测和监测，及时发现和淘汰患病禽群或带菌 禽群，并通过及时淘汰感染禽群的方法，以实现根除某种家禽疾病的过程。 DB37/T 4049 2020 2 4 诊断 4.1 临床诊断 4.1.1 鸡毒支原体病 参照 DB34/T 2160的临床症状和病理变化。 4.1.2 滑液囊支原体病 4.1.2.1 流行特点 感染通常见于 4周 16周龄的鸡。鸡群的患病率一般为 5 % 10 %，病死率不超过 10 %。 4.1.2.2 临床症状 引起的呼吸道症状不明显，受侵害部位在关节的滑液囊膜及腱鞘。出现关节肿胀、热痛、胸部龙骨 上水疱、跛行甚至站不起来，从而造成雏鸡或青年鸡生长发育受阻 ，产蛋鸡
6、生产性能下降，蛋壳质量变 差、易碎。 最初症状是鸡冠苍白、生长迟缓和关节肿胀，跗关节和爪垫是主要感染部位。随着病情的发展，出 现鸡冠萎缩、羽毛粗乱、跛行甚至站立不起。呼吸系统感染滑液囊支原体症状轻微，但感染禽是带菌者。 成年鸡群感染多表现为蛋壳质量变差、易碎。 4.1.2.3 病理变化 病禽主要表现为滑膜炎。在病情较轻时，在肿胀的关节部位可见到有多量黏稠的渗出液。严重时， 可见到腱鞘处有黄白色囊状物，内有白色黏液，关节滑液囊或脚垫内有黏液性呈灰白色的乳酪样渗出物， 有时关节软骨出现糜烂。趾关节和跗关节可见有异嗜性白细胞和纤维 素浸润。 4.2 病原分离培养 对可疑鸡群进行支原体病原的分离培养，
7、培养基配制、分离部位及培养条件等参照世界动物卫生组 织（ OIE）陆生动物诊断试验和疫苗标准手册相关内容进行。 4.3 血清学检测 对种鸡群鸡毒支原体和滑液囊支原体凝集抗体的检测，参照 GB/T 17999.4进行，在 2 min内出现凝 集者为阳性； 2 min内不凝集者为阴性；介于上述两者之间为可疑，进行复核试验，如仍为可疑，判为 阳性（见附录 B）。 4.4 核酸检测 聚合酶链式反应（ PCR）和环介导等温扩增技术（ LAMP）方法可任选其一。 4.4.1 试剂 除非另有说明，仅使用分析纯 试剂。 4.4.1.1 实验室用水应符合 GB/T 6682 的要求。 4.4.1.2 2 Taq
8、 PCR MasterMix 。 4.4.1.3 10 LAMP Amplification Buffer， -20 保存。 4.4.1.4 10 mmol/L Betaine 溶液：配制见附录 A.1， -20 保存。 DB37/T 4049 2020 3 4.4.1.5 Bst DNA Polymerase（ 6 U/ L）， -20 保存，避免反复冻融。 4.4.1.6 MgSO4(100 mmol/L) ：配制见附录 A.2， -20 保存。 4.4.1.7 dNTP 混合液 (10 mmol/L)， -20 保存，避免反复冻融。 4.4.1.8 SYBR Green 核酸染料 ， 4
9、 保存。 4.4.1.9 DNA Marker 2000， -20 保存，避免反复冻融。开盖后于 4 保存不超过 3 个月。 4.4.1.10 细菌基因组 DNA 提取试剂盒， 4 保存。 4.4.1.11 标准菌株，采用的 MG 标准菌株为 F-36 株，采用的 MS 标准菌株为 GX11-T 株。 4.4.2 仪器设备 4.4.2.1 PCR 扩增仪。 4.4.2.2 台式高速冷冻离心机：转速 12 000 r/min。 4.4.2.3 微量移液器： 2 L、 10 L、 100 L、 200 L、 1 000 L。 4.4.2.4 电子天平：精度 0.01 mg。 4.4.2.5 恒温水
10、浴锅或恒温金属浴。 4.4.2.6 涡旋仪。 4.4.2.7 生物安全柜。 4.4.2.8 电泳仪。 4.4.2.9 紫外透射反射分析仪。 4.4.3 样 品处理 取咽喉棉拭子。将棉拭子样品悬浮于 1 mL PBS溶液中，混匀成悬浮液。 4.4.4 DNA 提取 将棉拭子样品制成的混悬液 4 000 r/min离心 5 min，将离心后的上清置于新的 1.5 mL离心管中，在 4 条件下， 12 000 g离心 20 min，弃去上清液，并将沉淀物重新悬浮在 25 L 50 L的 0.1 %焦碳 酸二乙酯 (DEP)水中。按细菌基因组 DNA提取试剂盒说明书，提取 DNA。 4.4.5 聚合酶
11、链式反应（ PCR）方法 鸡毒支原体和滑液囊支原体的 PCR检测方法使用的引物及反应条件等参考 NY/T 553。 4.4.6 环介 导等温扩增技术（ LAMP）方法 4.4.6.1 引物 依据鸡毒支原体（ MG）的 mgc2基因序列和滑液囊支原体（ MS）的 16S rRNA序列，分别设计 LAMP引物， 扩增长度约 200 bp。 MG-F3： 5 -ACACTTGTTTTACATGAAGGT-3 MG-B3： 5 - CAACCATCTTTTGGTGTTCT-3 MG-FIP： 5 -ACAATCAACCCAGCACCTGCGTTGGTCCAAGAAAGATTACCT-3 MG-BIP：
12、 5 - TGTTTCTTTACTCTTGGGTTTAGGGTCACGTTCTTGGATCATCA-3 MS-F3： 5 - GCATTAAGCGGATCGGTT -3 MS-B3： 5 - AACTGCTGCATCAAGAGC -3 MS-FIP： 5 - TGTTGCTGCTGTGTATTTTTCTTCTGCAGTTAAAGATGATGCACAA-3 MS-BIP： 5 - ACTAGAAGATGGAACAAAACTTGCAGCAGATTCTAGATCACTTTGAGT-3 DB37/T 4049 2020 4 4.4.6.2 LAMP 反应条件 所采用的试剂盒反应体系见表 1。 表 1
13、禽支原体 LAMP 反应体系 反应组 分 体积 10Amp lification buffer 2.5 L dNTP 混合液 (10 mmol/L) 4.0 L F3/B3(10 mol/L) 0.5 L2 FIP/BIP(30 mol/L) 1 L2 Betaine(10 mmol/L) 2 L DNA 1 L BstDNAPolymerase(6 U/ L) 1 L MgSO4(100 mmol/L) 1 L ddH20 10.5 L 取 DNA模板 1-5 L置于分别加入鸡毒支原体 /鸡滑液囊支原体 LAMP引物已配置好的 上述试剂盒体系 内，在管盖内壁加 1 mL 1 000 SYBR
14、 Green，通过染料液滴本身的液体表面张力使得染料附着在管盖 上，从而避免染料在反应过程中接触反应液抑制反应，关闭管盖时需注意避免用力过大防止染料滴入反 应液。置于 63 水浴锅中，反应 60 min， 80 作用 10 min终止反应。 4.4.6.3 结果判定 瞬时离心 LAMP反应管，使管盖内侧壁的 SYBR Green 核酸染料与 LAMP反应体系充分混匀。在自然 光照下，阴性反应管不发生颜色变化，为橘红色，阳性反应管内液体变为黄色。反应管置于紫外透射反 射分析仪下， 阴性反应管不显现荧光，阳性反应管发出明亮的黄绿色荧光（见附录 C）。 5 净化检测规程 5.1 曾祖代和祖代鸡 5.
15、1.1 出壳雏鸡的检测与处置 5.1.1.1 雏鸡饲养管理 参照 T/CVMA 1的方法，将种蛋隔离孵化，出壳后小批量隔离饲养，减少孵出的雏鸡相互之间的感染 机会。 5.1.1.2 样品的收集 采集出壳后的雏鸡咽喉棉拭子，置于预先做好标记的 1.5 mL灭菌离心管，离心管中预先加入 0.5 mL 样品稀释液，充分震荡摇均。每次对一只鸡采样后，应注意更换一次性手套或对双手进行消毒，方可进 行另一只鸡采样，避免产生交叉的污染。 5.1.1.3 核酸检测和病原鉴定 将采集到的样品一分 为二。一部分样品用于进行 PCR或 LAMP检测（二选其一）。 PCR按照 NY/T 553 禽支原体 PCR检测方
16、法进行。 LAMP检测按照 4.4.6方法进行。一旦发现样品的 PCR或 LAMP检测阳性，则立 DB37/T 4049 2020 5 即对可疑样品的备份按照世界动物卫生组织（ OIE）陆生动物诊断试验和疫苗标准手册进行病原分离和 鉴定。 5.1.1.4 检测鸡群处置 淘汰所有 PCR或 LAMP检测阳性以及病原分离阳性的鸡，对于 PCR或 LAMP检测阳性但病原分离阴性的鸡 也应淘汰，同时淘汰同居鸡。对检测为阴性的鸡群应维持小群饲养。 5.1.2 育成期的检测和处置 5.1.2.1 鸡群临床观察 观察鸡群， 对有 4.1.1或 4.1.2临床症状的可疑育成期鸡进行淘汰。 5.1.2.2 抗体
17、检测 对全群 100 %采血，进行 SPA血清学检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的抗体。淘汰所有的鸡毒支原 体和鸡滑液囊支原体阳性鸡。对可疑的鸡群进行下一步的病原核酸检测。对检测为阴性的鸡群应维持小 群饲养。 5.1.2.3 可疑鸡群病原核酸检测 采集可疑鸡群的咽喉棉拭子样品进行 PCR或 LAMP，分别检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体。 5.1.2.4 检测鸡群处置 淘汰所有 PCR或 LAMP检测阳性的鸡。阴性鸡群应小群隔离饲养，作为后备育种鸡群。 5.1.3 开产前鸡群的检测和处置 5.1.3.1 鸡群临床观察 观察 开产前鸡群，对有 4.1.1或 4.1.2临床症状的可疑病鸡进行淘汰。 5
18、.1.3.2 抗体检测 同 5.1.2.2。 5.1.3.3 可疑鸡群病原核酸检测 同 5.1.2.3。 5.1.3.4 检测鸡群处置 淘汰所有血清学检测阳性和 PCR或 LAMP检测阳性的鸡。对检测为阴性的鸡群应维持小群饲养，作为 后备育种鸡群。 5.1.4 留种前的预防用药和检测以及处置 5.1.4.1 鸡群临床观察 观察留种鸡群，对有 4.1.1或 4.1.2临床症状的可疑病鸡进行淘汰。 5.1.4.2 鸡群检测 DB37/T 4049 2020 6 在留种前，对全群 100 %采血。其余的检测按照 5.1.2.2和 5.2.2.3进行。淘汰所有 PCR或 LAMP检测阳 性的鸡。对检
19、测为阴性的鸡群作为育种鸡群。 5.1.4.3 预防用药 在留种前 2周，按照 7.2进行选择用药。 5.1.5 种蛋的选留和孵化 按照本标准 5.1.1 5.1.4规定程序淘汰所有的阳性鸡后，每只母鸡仅选用 1只检测为阴性公鸡的精 液进行人工授精。按照育种规定的时间留足种蛋，对每只母鸡的种蛋进行标记。将每只母鸡的种蛋置于 标记有该母鸡标号的专用孵化纸袋（纸盒）中，防止不同母鸡的种蛋直接接触，置于孵化器中的特定出 雏箱中孵化出雏。种蛋上孵后，在孵化期内提升温度至 45 ，维持 14 h，以消灭种蛋中可能的支原体， 然后转入常规的孵化温度操作。 5.2 父母代 5.2.1 雏 鸡的检测和处置 采集
20、进场后的雏鸡咽喉棉拭子，处理同 5.1.1.2，分别进行 PCR或 LAMP，检测鸡毒支原体和鸡滑液囊 支原体。淘汰所有 PCR或 LAMP检测阳性的鸡。 5.2.2 育成期鸡群的检测和处置 同 5.1.2。 5.2.3 开产前鸡群的检测和处置 同 5.1.3。 5.2.4 留种前的预防用药和检测以及处置 同 5.1.4。 5.2.5 种蛋的选留和孵化 按照本标准 5.2.1 5.2.4规定程序淘汰所有的阳性鸡后，选用鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体检测为 阴性公鸡的精液进行人工授精或自然交配，按照常规的标准选留种蛋。利用该批种蛋孵化出的雏鸡作为 鸡毒支原体和鸡滑 液囊支原体净化后的商品代鸡群。 6
21、 净化周期启动和终止 6.1 检测时间的选择 曾祖代、祖代可以根据种鸡所处时期 5.1.1 5.1.4的任何一个时间点启动净化程序。父母代应在祖 代净化的基础上，再在 5.2.1 5.2.4的任何一个环节启动净化程序。不同种鸡场可以根据其具体条件选 择相关的检测技术，以提高鸡群检测的准确性，缩短净化周期。 6.2 净化标准评估 净化效果评估应按照国家农业行业主管部门制定的鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体病净化评估程序 和净化评估标准。净化评估标准见附录 D。 DB37/T 4049 2020 7 6.3 净化后检测比例的调整 按照 6.2所列要求判定为种鸡达 到鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体病净化状态的
22、鸡群建议不再按照 5.1.1 5.1.4或 5.2.1 5.2.4的净化程序进行全部的检测，转为按照不低于 10 %的比例进行抽检，如果 抽检不符合 6.2所列要求，则必须按照 5.1.1 5.1.4和 5.2.1 5.2.4的程序进行全部的检测，重新进行 净化。 7 注意事项 7.1 生物安全 7.1.1 种鸡场地理位置应相对隔离，远离其他鸡场。 7.1.2 在引进种蛋或鸡苗前，应先了解种禽场的净化情况，不能从有疫情的禽场引种。 7.1.3 接触种鸡群的工作人员应固定化，避免其他鸡群的饲养员进入实施净化的鸡群中工作。 7.1.4 禽舍在饲养 前需经过垃圾清除、高压水枪冲洗、福尔马林熏蒸等消毒
23、措施。 7.1.5 应加强饲养管理，降低饲养密度，注意通风，保持舍内空气新鲜，防止过热过冷、湿度过高， 定期清粪，防止氨气、硫化氢等有毒有害气体的刺激等。 7.1.6 运送物品车辆以及人员出入，均应执行消毒制度，同时应尽可能降低种鸡场所需物品与外界的 交流。 7.1.7 每周进行 2 次 3 次带鸡消毒喷雾，出现疫情时应每天进行带鸡消毒。 7.1.8 应坚持“全进全出”制，最大限度地避免多日龄鸡群混养。 7.1.9 对病死鸡、未出壳鸡胚、鸡粪和孵化场内废弃物按 NY/T 1168 和 DB63/T 1652 的要求进行无害 化处理。 7.2 药 物的预防 7.2.1 药物的使用应符合 NY/T
24、 5030 的要求。 7.2.2 药物使用应以药物敏感试验结果为基础，选用高敏药物。 7.2.3 推荐药物：泰乐菌素、泰妙菌素、北里霉素、恩诺沙星等，按标签说明剂量使用。 8 档案管理 做好种鸡鸡毒支原体和滑液囊支原体病净化工作记录，并归档保存。记录内容包括：平板凝集检测 抗原购进和检测记录、 LAMP或 PCR检测记录、各净化阶段种鸡的留种与淘汰记录等（附录 D）。记录保存 2年。 DB37/T 4049 2020 8 A A 附 录 A （资料性附录） 试剂的配制 A.1 10 mmol/L Betaine溶液 Betaine 1.171 5 g 灭菌水 10 mL 即配置成 1 mol/
25、L浓度，取 10 L加 DEPC水至 1 mL，制成 10 mmol/L Betaine溶液。 A.2 100 mmol/L MgSO4 MgSO4.7H2O 0.246 g 灭菌水 1 L DB37/T 4049 2020 9 B B 附 录 B （资料性附录） 血清平板凝集试验判定标准 血清平板凝集试验结果判定标准图见图 B.1。 图 B.1 血清平板凝集试验结果判定标准对照图（左为阳性，中为可疑，右 为阴性） DB37/T 4049 2020 10 C C 附 录 C （资料性附录） LAMP 反应结果判定 C.1 可见光下 LAMP反应结果判定 图 C.1 可见光下 LAMP 反应阳性
26、（绿色荧光）与阴性（橙黄色）对照图 C.2 紫外光下 LAMP反应结果 图 C.2 紫外光下 LAMP 反应阳性（绿色荧光）与阴性（无荧光）对照图 DB37/T 4049 2020 11 D D 附 录 D （资料性附录） 鸡毒支原体病和滑液囊支原体病净化评估标准 D.1 净化标准评估 同时满足以下要求，视为达到净化标准： 种鸡群抽检，鸡毒支原体和滑液囊支原体病原学检测均为阴性； 连续两年以上无临床病例； 种鸡群抽检，曾祖代、祖代鸡毒支原体和滑液囊支原体血 清学抗体检测阳性率为 0，父母代鸡 毒支原体和滑液囊支原体血清学抗体检测阳性在 1 %以内； 现场综合审查通过。 D.2 抽检要求 同时满
27、足以下要求： D.2.1 血清学评估 种鸡群随机抽取 150只鸡血清，按照 GB/T 17999.4 2008的方法进行 SPA血清学检测。曾祖代或祖代 鸡群鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体抗体应全部为阴性，实验室检测通过；如抗体出现阳性，则实验室不 通过。父母代鸡群鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体抗体阳性率均应低于 1 %，实验室检测通过；如抗体阳 性率高于 1 %，则实验室不通过。 D.2.2 病原学评估 种鸡群（含所有鸡群）随机 按 3 % 5 %比例取棉拭子样品，进行 PCR或 LAMP病原学检测抽检，如果 病原检测均为阴性，则判定种鸡达到禽鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体病净化状态，实验室检测通过；如
28、 果病原核酸检测阳性，则实验室不通过。 DB37/T 4049 2020 12 E E 附 录 E （资料性附录） 种鸡群净化记录表 表 E.1 种鸡群净化鸡毒支原体检测记录表 鸡场名称： 检测日期： 页码 1/2 种鸡品种 种群规模（羽） 周龄（ W） 净化世代 抽检量 检测项目 鸡毒支原体 （ MG） MG 抗原及 标准血清批号 平板凝 集反应 SPA 阴性编号 阳性编号 可疑编号 PCR 或 LAMP 阴性编号 阳性编号 淘汰鸡编号 DB37/T 4049 2020 13 表 E.2 种鸡群净化滑液囊支原体检测记录表 鸡场名称： 检测日期： 页码 2/2 检测项目 滑液囊支原体（ MS） MS 抗原及 标准血清批号 平板凝 集反应 SPA 阴性编号 阳性编号 可疑编号 PCR 或 LAMP 阴性编号 阳性编号 药物使用 淘汰鸡编号 _
