1、 ICS 65.150 DB37 B 51 山东省地方标准 DB37/T 420.1-2004 海水养殖鱼类指状拟舟虫病诊断规程 第一部分：组织学诊断法 2004-12-14 发布 2005-01-01 实施 山东省质量技术监督局 发布 DB37/T420.1-2004 I 前 言 本标准由山东省海洋与渔业厅提出。 本标准由山东省渔业标准化专业技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省海水养殖研究所。 本标准起草人：李天保、叶海斌、刘恩孚、朱安成、吴志宏。 DB37/T420.1-2004 1 海水养殖鱼类指状拟舟虫病诊断规程 第一部分：组织学诊断法 1 范围 本标准规定了指状拟舟虫病组织学诊断
2、所需试剂与材料、检验步骤和结果判定。本部分诊断结果可 疑时，补充扫描电镜诊断进行结果确认。 本标准适用于海水养殖鱼类，包括牙鲆、大菱鲆、真鲷等养殖鱼类品种，感染指状拟舟虫情况的筛 选和诊断。 2 指状拟舟虫病的病理学特征 指状拟舟虫是海水鱼类养殖过程中引发寄生虫疾病的主要寄生虫之一。感染指状拟舟虫可导致鱼类 肌肉组织及脑组织严重病变、坏死，并大量寄生于循环系统中吞噬血细胞，导致贫血。感染初期，在鱼 的体表以及口腔粘膜等处发生溃烂，严重时侵入鱼体内，常继发感染致病性细菌导致鱼类死亡率增高。 3 试剂和材料 若非注明，本标准使用确认为分析纯试剂。 石蜡（熔点5254）：切片级。 二甲苯。 盐酸。
3、石炭酸。 无水乙醇。 95%乙醇。 90%乙醇。 80%乙醇。 75%乙醇。 70%乙醇。 苏木素：生物染色素。 伊红Y（水溶性）：生物染色素。 中性树胶。 过滤海水：盐度为2030的海水在室内放置一周后，经滤纸和0.22m滤膜过滤。 Bouins液按附录A的规定。 苏木精-伊红染色液按附录A的规定。 4 检验步骤 5.1 取体表溃烂的病鱼，取体表溃烂组织块，组织块大小约 0.3cm0.5cm，Bouins 液固定 24h，蒸馏 水冲洗后移入 70%乙醇中保存。 5.2 组织块经各级乙醇脱水、石蜡包埋，切片厚度为5m 7m。 5.3 切片制备过程见附录B，苏木精-伊红染色后封片，并检查。 DB
4、37/T 420.1-2004 2 5 结果判定 在表皮溃烂组织样品中有指状拟舟虫为阳性。 表皮溃烂组织样品中没有发现指状拟舟虫为阴性。 DB37/T420.1-2004 3 附 录 A （规范性附录） 试剂配方 A.1 苏木精液 苏木精2g，无水乙醇250ml，硫酸铝17.6g，蒸馏水7 50ml。碘酸钠0.2g，冰醋酸25ml。 先将苏木精溶于无水乙醇，再将硫酸铝溶于蒸馏水中。两液溶解后将其混合，加入碘酸钠，最后加 入冰醋酸。 A.2 水溶性伊红染液 伊红Y 0.25g-0.5g，蒸馏水100ml。 先取少量蒸馏水加入伊红，用玻璃棒将伊红研碎，再加入全部蒸馏水。 A.3 Bouins液 饱
5、和苦味酸水溶液75ml，甲醛水溶液25ml，冰醋酸5ml。 A.4 盐酸乙醇分化液 盐酸0.5ml，75%乙醇100ml。 DB37/T 420.1-2004 4 附 录 B （资料性附录） 组织切片方法 B.1 组织脱水 使用乙醇为脱水剂，脱水顺序和时间如下表： 乙醇浓度 75% 85% 90% 95% 95% 无水乙醇 无水乙醇 无水乙醇 脱水时间 5h10h 5h10h 5h10h 5h10 h 5h10h 30min 30min 1h2h 脱水必须在有盖子的瓶子中进行，以防乙醇吸收空气中水分。 B.2 组织透明 用二甲苯进行组织透明，将脱水完毕的组织块置于滤纸上用冷风稍吹干后，放入二甲
6、苯中进行透明 处理。处理过程分三个步骤，第一和第二步各处理30min，第三步处理1h。 B.3 浸蜡 将经二甲苯透明后的组织块用冷风稍干并立即投入到液体石蜡中去，石蜡温度5254，浸蜡三 次，时间分别为1h2h、1h2h和2h4h。 B.4 包埋 在5254融蜡炉中将石蜡熔融后，倒入预先放入组织块的包埋盒中，应注意组织的切面朝下并 放平整，石蜡凝固，将包埋盒打开，用刀片把组织蜡块切开，待完全冷却变硬后，再修整蜡块。 B.5 切片 把组织蜡块装在切片机上，左手平持毛笔，右手旋动切片机把，切片带出来后，用毛笔轻轻托起， 再用眼科镊子轻镊蜡片，以正面放入展片箱中，其温度可根据石蜡熔点选用，待摊平后捞
7、片。切片附片 时，左手持清洗好的载玻片的一端，插入水中附贴组织片，右手用镊子或毛笔辅助推动，待组织片附贴 于载玻片上后，再移至载玻片中央。附片后，在空气中稍凉干即可进行烤片。 B.6 脱蜡 二甲苯处理两次，每次2min5min；无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇和75%乙醇各处理1min；自来水 和蒸馏水各洗2min。 B.7 染色 苏木精液染色5min，自来水洗1min，75%盐酸乙醇分化30s，自来水洗，温水（50）5min，蒸馏水 1min，95%乙醇1min，伊红Y 1min2min。 B.8 脱水、透明和封片 95%乙醇1min， 95%乙醇重复一次， 无水乙醇1min， 重复无水乙醇1min， 二甲苯-石炭酸液 （3:1） 1min， 二甲苯1min，重复二甲苯1min，中性树胶封片。
