1、ICS 11.220 B 41 DB37 山东省 地方标准 DB37/T 4032 2020 非洲猪瘟恒温扩增检测技术规范 Technical specification for isothermal amplification detection of African swine fever 2020 - 07 - 09 发布 2020 - 08 - 09 实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 4032 2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：
2、山东省农业科学院畜牧兽医研究所、山东师范大学、中国动物卫生与流行病学中 心、山东鼎科检测技术有限公司、潍坊安普未来生物科技有限公司、上海 基灵生物科技有限公司、潍坊 汉森生物饲料科技有限公司。 本标准主要起草人：孙文博、吴家强、陈蕾、殷斌、陈智、吴晓东、蒋文明、刘国宪、郑乾坤、李 敏、杜以军、于江、时建立、吴香菊、李俊、丛晓燕、郭立辉。 DB37/T 4032 2020 1 非洲猪瘟恒温扩增检测技术规范 1 范围 本标准规定了非洲猪瘟病毒（ ASFV），英文缩略表见附录 D，核酸的重组酶聚合酶扩增（ RPA）检测 技术的要求。 本标准适用于非洲猪瘟的快速检测、诊断、检疫、监测和流行病学调查。
3、2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 核酸恒温扩增技术是依赖解旋酶解开双链 DNA，依赖单链 DNA结合蛋白与模板单链结合，使模板处于 单链状态并保护它的完整性。引物与模板杂交，然后在 DNA聚合酶的催化下开始扩增。 4 试剂或材料 除非另有规定，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。 4.1 水： GB/T 6682，一级水。 4.2 1 PBS 溶液 (pH 值 7.4)：配制见附录 A.1。
4、 4.3 核酸提取试剂： a) 蛋白酶 K 溶液（ 20 mg/mL）：配制见附录 A.2； b) 10 %十二烷基硫酸钠（ SDS 溶液， pH7.2）：配制见附录 A.3； c) Tris 平衡酚； d) 三氯甲烷； e) 70 %乙醇：配制见附录 A.4。 4.4 重组酶聚合酶恒温扩增试剂盒。 4.5 DEPC 水。 4.6 恒温扩增检测的引物：恒温扩增检测引物见附录 B.1。 4.7 无水乙醇。 4.8 微量移液器配套的带滤芯吸头。 4.9 离心管： 1.5 mL。 5 主要仪器设备 DB37/T 4032 2020 2 5.1 微量移液器：最大量程分别为 10 L、 20 L、 10
5、0 L、 1 000 L。 5.2 生物安全柜。 5.3 普通冰箱。 5.4 涡旋振荡器。 5.5 研磨管。 5.6 荧光定量 PCR 仪： Peltier 加热， 16 孔（ 0.2 mL， 2 8 联管和单管）。 5.7 电子天平：感量为 0.001 g。 5.8 低温高速台式离心机：离心力 8 000 g。 6 样品 6.1 基本要求 应符合 GB 19489 2008和 NY/T 541 2016中关于实验室生物安全和兽医诊断样品采集、保存与运输 的要求。 6.2 样品采集 6.2.1 棉拭子样品 无菌操作，采集猪口腔拭子。 6.2.2 组织样品 无菌操作，取猪的脾、肺、肾、扁桃体、淋
6、巴结、肌肉等组织样品。 2 8 低温运至实验室。 6.2.3 环境样品 相关场所的粪便、饲料、污水样品。 2 8 低温运至实验室。 6.3 样品处理 6.3.1 口腔拭子样品处理 口腔拭子管 6 000 r/min震荡 45 s，取 200 L进行核酸提取。 6.3.2 脾、肺、肾等组织样品处理 取 0.05 g组织块放入盛有 PBS缓冲液的研磨管中， 6 000 r/min震荡研磨 45 s，制成约 10 %的组织匀 浆液， 5 000 g离心 5 min，取 200 L上清液进行核酸提取。 6.3.3 粪便、饲料样品处理 取 1 g粪便、饲料放入盛有 PBS缓冲液的研磨管中， 6 000
7、r/min震荡研磨 45 s，制成约 10 %的匀浆 液， 5 000 g离心 5 min，取 200 L上清液进行核酸提取。 6.3.4 污水样品处理 取 200 L污水进行核酸提 取。 7 操作步骤 DB37/T 4032 2020 3 7.1 取 6.2 处理后的样品 500 L 加入 10 %SDS 溶液 50 L、 20 mg/mL 蛋白酶 K 溶液 10 L，于 55 水浴 2 h 3 h。 7.2 加入 200 L Tris 平衡酚，混匀， 4 12 000 g 离心 15 min。 7.3 取上清液 500 L，加入 200 L Tris 平衡酚和 200 L 三氯甲烷， 4
8、12 000 g 离心 15 min。 7.4 取上清液 400 L，加入 200 L 三氯甲烷， 4 12 000 g 离心 15 min。 7.5 取上清液 300 L，加入 2 倍体积的无水乙醇， -20 静 置 20 min， 4 12 000 g 离心 15 min。 7.6 弃上清液，加入 1 mL 70 %的乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。 7.7 加入 20 L 灭菌一级水溶解沉淀， -20 保存备用。 7.8 也可选择市售商品化 DNA 提取试剂盒，完成 DNA 的提取。 7.9 设 50 L 反应体系，详见附录 B.2。 7.10 每次反应设置试验中同时质粒 DNA
9、作为阳性对照和灭菌双蒸水作为阴性对照。具体反应程序见附 录 B.3。 8 结果判定 8.1 结果判读见表 1。 表 1 结果判定 序号 通道 Ct 值 结果判断 1 FAM 未检测到 或 40 样本 核酸浓度 低于检测限，报告为 阴性 2 FAM 37 报告为阳性 3 FAM 37-40 复检一次，如仍为 37-40，则报告为阴性 8.2 阴性对照和阳性对照，有任一结果异常，需要重新检测。 8.3 结果参考图谱：见附录 C.1。 DB37/T 4032 2020 4 A A 附 录 A （规范性附录） 试剂的配制 A.1 1 PBS溶液 (pH值 7.4) 磷酸二氢钾 (KH2PO4)： 0.
10、27 g。 磷酸氢二钠 (Na2HPO4)： 1.42 g。 氯化钠 (NaCl)： 8 g。 氯化钾 (KCl)： 0.2 g。 加灭菌水约 800 mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调 pH值至 7.4，最后定容到 1 L。 A.2 蛋白酶 K溶液 (20 mg/mL) 蛋白酶 K 100 mg 灭菌一级水 5 mL A.3 10 %十二烷基硫酸钠 (SDS溶液， pH7.2) 十二烷基硫酸钠 10 g 灭菌一级水 80 mL 浓盐酸 调 pH至 7.2 灭菌一级水 加至 100 mL A.4 70 %乙醇 无水乙醇 70 mL 灭菌一级水 30 mL DB37/T 4032 2020 5
11、B B 附 录 B （规范性附录） 恒温核酸扩增引物、反应液体系与反应条件 B.1 恒温核酸扩增引物 见表 B.1。 表 B.1 恒温核酸扩增引物 引物 序列 Asfv-F 5 - CTTCAAAGCAAAGGTAATCATCATCGCAC-3 Asfv-R 5 - GAGATACAGCTCTTCCAGAYGCATGTTCATC -3 Asfv-Probe 5 -AGAGCTGCAGAACTTTGATGGAAACTTAFCTABAAGATTGATACCATG-3 注： F为 FAM荧光基团标记、 T为 THF、 B为 BHQ1淬灭基团标记、 3末端为 C3 Spacer标记。 B.2 恒温核酸
12、扩增反应液体系 见表 B.2。 表 B.2 恒温核酸扩增反应液体系 组分 用量 L DEPC 水 8.5 A Buffer 29.4 10 M 上游引物 2 10 M 下游引物 2 10 M 探针 0.6 模板 DNA 5 B Buffer 2.5 B.3 恒温核酸扩增反应条件 见表 B.3。 表 B.3 恒温核酸扩增反应条件 反应 条件 反应 温度 39 C 循环 数 40 信号 采集 每 30S 反应 时间 20 min DB37/T 4032 2020 6 C C 附 录 C （规范性附录） 样品检测结果图 样品检测结果见图 C.1。 图 C.1 样品检测结果图 DB37/T 4032 2020 7 D D 附 录 D （规范性附录） 英文缩略表 英文缩略表见表 D.1。 表 D.1 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名 ASFV African swine fever virus 非洲猪瘟病毒 RPA Recombinase polymerase amplification 重组酶聚合酶扩增 PBS phosphate buffer saline 磷酸缓冲盐溶液 DEPC diethyl pyrocarbonate 焦碳酸二乙酯 PCR Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应 _
