1、ICS 65.120 B 46 DB37 山东省 地 方 标 准 DB 37/T 4000 2020 羊 A型产气荚膜梭菌 PCR和 ELISA检测技术 规程 Technical specification for detection of sheep clostridium perfringens by PCR and ELISA 2020 - 06 - 08 发布 2020 - 07 - 08 实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 4000 2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并 组织 实施。 本标准由山东省畜
2、牧业标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位：山东农业大学、山东省动物疫病预防与控制中心。 本标准主要起草人：朱瑞良、魏凯、 闫振贵、彭军、 胡莉萍、黄河、杨萍萍 、柳洪洁、曹振山、王 敏、王世荣、郝长宝 。 DB37/T 4000 2020 1 羊 A 型产气荚膜梭菌 PCR 和 ELISA 检测技术规程 1 范围 本 标准 规定了 羊 A型产气荚膜梭菌 PCR和 ELISA检测方法的技术规范。 本 标准 适用于 羊 A型产气荚膜梭菌 PCR和 ELISA的检测 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期
3、的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 14925 实验动物 环境及设施 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本 文件 。 3.1 一抗 酶联免疫吸附试验（ ELISA）中用于与包被的抗原结合的抗体称为一抗。阴阳性血清和待检血清统 称为一抗。 3.2 二抗 酶联免疫吸附试验（ ELISA）中用于与 一抗 结合的 抗 抗体称为 二 抗。 本标准中兔抗羊 IgG抗体为二 抗。 4 试剂或材料 4.1 产气荚膜梭菌 使用 A型 产气荚膜梭菌标准株 CVCC41。 4.2 产气荚膜梭菌阳性血清 羊 经免疫产气荚膜梭菌抗原 3次后
4、获得的血清，每次免疫间隔两周。 抗体中和试验检测效价高于 1:256（附录 A）。 4.3 阴性血清 从健康的未感染未免疫的羊 分离的血清 （附录 A） 。 DB37/T 4000 2020 2 4.4 生化试剂 灭菌 0.5%石炭酸生理盐水、 PBS、 PBST、 Tris-HCL、牛血清白蛋白（ BSA）、底物反应液（具体配制 方法见附录 B）； PCR buffer； dNTP； Taq 聚合酶；溴酚蓝；二甲苯青；蔗糖； Tris-乙酸；乙二胺四乙 酸（ EDTA）；溴化乙锭；琼脂糖； Tween-20； 考马斯亮蓝 G-250；考马斯亮蓝 R-250； 邻苯二胺（ OPD）； 30%丙
5、烯酰胺；十二烷基硫酸钠（ SDS）；过硫酸铵（ AP）；四甲基乙二胺（ TEMED） ；甲醛溶液； FT培 养基；产毒培养基；酵母浸膏粉；蛋白胨； L-精氨酸；糊精。 4.5 水 试验 用水 符合 GB/T 6682三级水 的规定。 5 仪器设备 5.1 微量移液器：量程为 20 L 100 L。 5.2 PCR管 ： 200 L体积。 5.3 灭菌吸管 ： 1.0 mL。 5.4 恒温培养箱。 5.5 匀速振荡器。 5.6 离心机 ： 转速 不低于 16000 r/min。 5.7 96孔 ELISA酶标板。 5.8 PCR仪。 5.9 酶标仪 ： 波长范围 340 nm 850 nm。 5
6、.10 分光光度计。 5.11 玻璃比色皿。 6 产气荚膜梭菌 PCR 检测方法 6.1 本检测方法在 200 L 的离心管中进行，所使用的引物如下： 表 1 产气荚膜梭菌 PCR 引物序列 Primers Primer sequence (5-3) Size (bp) CPA-F TATGAATGGCAAAGAGGA 589 CPA-R ACTAAAATACTGACCTTC 6.2 所用的上样缓冲液为：质量 /体积比为 0.25的溴酚蓝，质量 /体积比为 0.25%的二甲苯青，质量 / 体积比为 40%的蔗糖水溶液。 6.3 所用的含溴化乙锭的琼脂糖凝胶为由 0.04 M的 Tris-乙酸和
7、 0.001M的乙二胺四乙酸（ EDTA）组 成的 TAE缓冲液配制的，其中含 0.5 g/mL的溴化乙锭和质量 /体积比为 1.5%琼脂糖。 6.4 试验步骤如下： a) 将过夜培养的病原菌，采用细菌基因 组 DNA提取试剂盒抽提细菌的基因组 DNA； b) 以上述细菌基因组 DNA为模板进行 PCR扩增。 PCR扩增反应体系 （ 50 L） 为： 10PCR buffer （ 含 Mg2+） 5.0 L、 2.5 mmol/L dNTP 4.0 L、 Taq 聚合酶 0.3 L、模板为 2.0 L、引物浓 度为 10 pmol/L，用补齐至 50 L； DB37/T 4000 2020 3
8、 c) PCR扩增反应条件为：预变性 94 7 min； 94 变性 30 s、 56 退火 30 s、 72 延伸 45 s， 30个循环；产物末端 72 延伸 10 min； d) PCR扩增产物加入上样缓冲 液后，再加样于含 0.5 g/mL溴化乙锭的 1.5琼脂糖凝胶中，进 行琼脂糖凝胶电泳检测。 6.5 结果判定 紫外成像仪下观察 PCR产物凝胶电泳，如果出现 589 bp的目的条带（如图 1），则判定为产气荚膜梭 菌。 图 1 PCR 目的条带图示 注： M代表 DNA Marker； 1, 2, 3, 4代表检测样本。 7 ELISA 检测方法 7.1 包被 包被：将产气荚膜梭菌
9、毒素蛋白用包被液（ 0.05 mol/L碳酸盐缓冲液， pH9.6）稀释成 10 g/mL， 包被酶标板。 7.2 封闭 用 PBST洗涤酶标板 5次。每孔加入封闭液（含 1% BSA的 PBS） 200 L，置于湿盒内， 4 封闭过夜。 7.3 一抗孵育 用 PBST洗涤酶标板 5次。取 1孔加入 1:10倍稀释羊抗产气荚膜梭菌 毒素高免血清作为阳性对照（制 备方法见附录 B），取 1孔加入 1:10倍稀释的羊阴性血清作为阴性对照（制备方法见附录 B）；其它孔加 1:10稀释的待检血清，置湿盒内 37作用 60 min。抗体稀释液为 1 BSA的 PBS。 7.4 二抗孵育 用 PBST洗涤
10、酶标板 5次。加入 1:5000稀释的 HRP标记的兔抗羊 IgG（抗体稀释液为 1 BSA的 PBS）， 置湿盒内 37作用 45 min。 7.5 底物显色 用 PBST洗涤酶标板 5次。加底物反应液，置湿盒内 37避光显色 20 min。 DB37/T 4000 2020 4 7.6 读数 最后用 2.0 mol/L的 H2SO4溶液终止反应，以酶标仪检测样品的 OD490值。 7.7 结果判定 以待测孔的 OD值大于或等于阴性对照孔的 2倍者，即 P/N大于或等于 2判为阳性，重复 3次计算平均值。 DB37/T 4000 2020 5 A A 附 录 A （资料性附录） 羊产气荚膜梭
11、菌毒素的提取和抗血清的制备 A.1 羊产气荚膜梭菌 毒素蛋白 的提取 A.1.1 将保存的羊 A型产气荚膜梭菌标准株（ CVCC41）接种于 200 mL FT培养基中进行增菌， 37厌氧 培养 12 h。 A.1.2 将增菌液以 5%的比例接种 到产毒培养基（配制方法见附录 A）中， 43厌氧培养 5 h-6 h 进行 产毒。产毒结束，离心（ 12000 r/min， 30 min） 取上清，离心后用 0.22 m 的滤器过滤取上清。 A.1.3 将过饱和硫酸铵溶液缓慢加入到上述所制得上清中，使其终浓度达到 40%， 4静置过夜。 A.1.4 离心（ 10000 r/min， 20 min）
12、保留 沉淀，用同体积的含 2% Triton X-100的 Tris-MgCL2缓冲液 溶解 。 A.1.5 溶解完成后，向管内加入过饱和硫酸铵溶液使其终浓度为 40%，再次离心方法同上，最后取 3. 0 mL 0.05M 的 Tris-HCL 缓冲液（ PH=7.5）溶解沉淀。 A.2 羊产气荚膜梭菌 毒素蛋白 含量测定 A.2.1 采用 Bradford方法，具体操作步骤如下： a) 取 16支试管， 1支作空白， 3 支留作未知样品，其余试管分为两组，分别加入样品、水和试剂， 即用 1.0 mg/mL 的标准蛋白质溶液给各试管分别加入： 0 mL、 0.01 mL、 0.02 mL、 0
13、.04 mL、 0.06 mL、 0.08 mL、 0.1 mL，然后用无离子水补充到 0.1 mL； b) 最后各试管中分别加入 5.0 mL考马斯亮兰 G-250 试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上 混 合（不 能 太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除） ； c) 加完试剂 2 min-5 min 后，即可开始用玻璃比色皿，在分光光度计上测定各样品在 595 nm 处 的光吸收值 A595，空白对照为第 1号试管，即 0.1 mL水加 5.0 mL 考马斯亮兰 G-250试剂。 比色皿使用后立即用少量 95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时 间浸泡 ； d) 用标准
14、蛋白质量（ mg）为横座标，用吸光度值 A595 为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。 由此标准曲线，根据测出的未知样品的 A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。 0.5 mg牛 血清蛋白 /mL溶液的 A595约为 0.50。 A.2.2 微量法 ： 当样品中蛋白质浓度较稀时 （ 10 mg/mL-100 mg/mL） ，可将取样量（包括补加的水）加大到 0.5 mL 或 1.0 mL，空白对照则分别为 0.5 mL或 1.0 mL水， 考马斯亮蓝 G-250试剂仍加 5.0 mL, 同时作相应的标 准曲线，测定 595 nm的光吸收值。 0.05 mg牛血清蛋白 /mL溶液的 A595
15、约为 0.29。 A.3 羊产气荚膜梭菌 毒素 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)检测 A.3.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （ SDS-PAGE） 采用解离非连续缓冲系统垂 直板电泳。 A.3.2 使用浓缩胶为 5%， 分离胶为 12%的不连续聚丙烯酰胺凝胶 （附录 B） 。 DB37/T 4000 2020 6 A.3.3 电泳结束，采用考马斯亮蓝 R-250染色，以标准低蛋白分子量的对数值和电泳迁移率绘制标准曲 线，求出各蛋白分子量。 A.4 产气荚膜梭菌毒素抗血清 的制备 A.4.1 将甲醛缓慢的加入到含有 毒素的溶液中使甲醛终浓度达到 0.3%，混匀后，在 37 条件下将外 毒素灭活
16、 96 h，期间每隔 5 h-6 h 振荡一次混合液。 A.4.2 将灭活的羊产气荚膜梭菌 毒素蛋白液与弗氏不完全佐剂混合（ V:V=1:1），用漩涡振荡器乳化， 制备羊产气荚膜梭菌 毒素免疫用抗原。 A.4.3 选取 15 kg左右的健康未感染未免疫的羊 2只，肌肉注射免疫 毒素抗原，共免疫 3次，每次间隔 2 周， 毒素免疫剂量为 10 mg/只 /次。饲养环境饲养符合 GB 14925实验动物环境及设施国家标准的要 求。 A.4.4 最后 1次免疫后 7 d采血，抗体中和试验检测血清中羊抗羊产气荚膜梭菌 毒素抗体的效价，效价 高于 1： 256以上时采血，分离血清， -20 保存备用。
17、A.5 阴性血清制备 采集健康未感染过产气荚膜梭菌的羊，制备阴性血清。 DB37/T 4000 2020 7 B B 附 录 B （规范性附录） 溶液的配制 B.1 灭菌 0.5%石炭酸生理盐水的配制 称取 9.0 g氯化钠（ NaCl）溶于水，定容到 1.0 L，再加入 5.0 mL苯酚。配制后高压灭菌器灭菌后使 用。 B.2 磷酸盐缓冲液（ PBS）的配制 1 mol/L PBS（ pH 7.2）的配方 如下 ： a) 氯化钠（ NaCL） ： 8.0 g； b) 氯化钾（ KCL） ： 0.2 g； c) 磷酸氢二钠 (Na2HPO4)： 1.44 g； d) 磷酸二氢钾 (KH2PO4
18、) ： 0.24 g； e) 加水 900 mL，调 pH等于 7.2，定容至 1000 mL。 B.3 PBST缓冲液的配制 1.0 L PBS + 1.0 mL Tween-20。 B.4 牛血清白蛋白（ BSA） 将 100 mg的牛血清白 蛋白加入 9.5 mL水中（须将蛋白加入水中，而不是将水加入蛋白中），盖好盖 后，轻轻摇动，直至牛血清白蛋白完全溶解为止。加水定容到 10 mL，然后分装成小份，贮存于 -20 。 B.5 Tris-HcL缓冲液的配制 配方如下： a) Tris 碱 ： 121.1 g； b) 浓盐酸（ 1mol/L HCl） ： 42.0 mL； c) 水： 定容
19、至 1000 mL。 在 900 mL水中加入 121.1g Tris 碱，溶液冷却至室温后调节溶液 pH值至 8.0，然后定容至 1000 mL， 分装后高压蒸汽灭菌 30 min，室温保存。 B.6 5%浓缩胶配制 配方 如下： a) 水 ： 2.1 mL； b) 30%丙烯酰胺 ： 0.5 mL； DB37/T 4000 2020 8 c) 1.0M Tris-HCL buffer： 0.38 mL； d) 10%SDS： 0.03 mL； e) 10%过硫酸铵（ AP） ： 0.03 mL； f) TEMED： 0.003 mL。 B.7 12%分离胶配制 配方如下： a) 水 ： 1.65 mL； b) 30%丙烯酰胺 ： 2.0 mL； c) 1.0M Tris-HCL buffer： 1.25 mL； d) 10%SDS： 0.05 mL； e) 10%过硫酸铵（ AP） ： 0.05 mL； f) TEMED： 0.004 mL。 B.8 底物反应液的配制 取 10 mL磷 酸盐柠檬酸缓冲液，加邻苯二胺（ OPD） 4.0 mg和 3 H2O2 15 L。 B.9 产毒培养基 的配制 称取酵母浸膏粉 2.0 g、蛋白胨 2.0 g、 L-精氨酸 1.2 g、糊精 1.0 g加入 100 mL PBS缓冲液调节 pH为 7.4。 _
