1、ICS 11.220 B 41 DB37 山东省 地方标准 DB37/T 4052 2020 小反刍兽疫恒温扩增检测技术规范 Technical specification for isothermal amplification of Peste des petits ruminants 2020 - 07 - 09 发布 2020 - 08 - 09 实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 4052 2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东
2、师范大学、山东省农业科学院、中国动物卫生与流行病学中心、杭州众测生 物科技有限公司、桂林市临桂区动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人 ：陈蕾、孙文博、吴晓东、陈艳如、廖炳次、蒋文明、李华、刘腾腾、杨慧婷、 单世娟、陈秋红、孙晓洁、杨桂文。 DB37/T 4052 2020 1 小反刍兽疫恒温扩增检测技术规范 1 范围 本标准规定了小反刍兽疫（ PPR）的恒温核酸扩增检测技术的要求。 本标准适用于小反刍兽疫的快速检测、诊断、检疫、监测和流行病学调查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新
3、版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 2008 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 2016 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 原理 核酸恒温扩增技术是依赖解旋酶解开双链 DNA，再依赖单链 DNA结合蛋白与模板单链结合，使模板单 链处于单链状态并保护它的完整性。引物与模板杂交，然后在 DNA聚合酶的催化下扩增。 4 试剂或材料 除非另有规定，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。 4.1 水：符合 GB/T 6682 中规定的一级水。 4.2 1 PBS 溶液（ pH 值 7.4）配制见附录 A.1。 4.3
4、核酸提取试剂： a) Trizol； b) 氯仿； c) 75 %乙醇； d) 异丙醇 。 4.4 恒温扩增试剂盒。 4.5 不含 RNA 酶的水： DEPC 处理过的不含 RNA 酶的水。 4.6 恒温扩增检测引物：恒温扩增检测引物表 B.1。 4.7 无水乙醇。 4.8 微量移液器配套的带滤芯吸头。 4.9 离心管： 1.5 mL。 5 材料及设备 DB37/T 4052 2020 2 主要仪器设备： a) 微量移液器： 10 L、 20 L、 100 L、 1 000 L； b) 高速台式离心机：离心力 8 000 g； c) 生物安全柜； d) 冰箱； e) 涡旋振荡器； f) 研磨管
5、； g) 荧光定量 PCR 仪； h) 天平：感量为 0.001 g。 6 样品 6.1 基本要求 应符合 GB 19489 2008和 NY/T 541 2016中关于实验 室生物安全和兽医诊断样品采集、保存与运输 的要求。 6.2 样品采集 6.2.1 棉拭子样品 无菌采集羊口鼻棉拭子。 6.2.2 组织样品 无菌采集病死羊的淋巴结、脾、胸腺、肠粘膜和肺等组织样品。 2 8 低温运至实验室用于检 测。 6.2.3 环境样品 采集与病羊相关场所的粪便、饲料、污水样品。 2 8 低温运至实验室。 6.3 样品处理方法 6.3.1 口鼻拭子样品处理 口鼻拭子管 6 000 g震荡 45秒，取 2
6、00 L进行核酸提取。 6.3.2 淋巴结、脾、胸腺等组织样品处理 取 0.05 g组织块放入盛有 PBS缓冲液的研磨管中， 6 000 g震荡研磨 45秒，制成约 10 %的组织匀浆液， 5 000 g离心 5 min，取 200 L上清液进行核酸提取。 6.3.3 粪便、饲料样品处理 取 1 g的粪便、饲料放入盛有 PBS缓冲液的研磨管中， 6 000 g/min震荡研磨 45秒，制成约 10 %的匀 浆液， 5 000 g/min离心 5 min，取 200 L上清液进行核酸提取。 6.3.4 污水样品处理 取 200 L污水进行核酸提取。 DB37/T 4052 2020 3 7 操作
7、步骤 7.1 RNA 的提取 Trizol 法 7.1.1 取 6.2 处理后的样品向处理好的 300 L 组织样品或血清中加入 800 L Trizol，重复吹打以 裂解细胞（或者剧烈振荡），冰上放置 10 min 25 min。 7.1.2 加入氯仿 200 L，用力振荡 30 s，室温放置 5 min。 7.1.3 4 ， 8 000 g 离心 15 min，吸取上层液体 500 L 于 1.5 mL 离心管中。 7.1.4 加入 1.0 mL 异丙醇， -20 沉淀 RNA 至少 1 h。 7.1.5 4 8 000 g 离心 10 min，弃上清，用 75 %的乙醇洗涤沉淀， 8 0
8、00 g 离心 5 min，彻底弃去 上清，自然条件下干燥沉淀，溶于 50 L DEPC 处理的灭菌水中， -20 贮存，备用。也可选择市售商 品化 RNA 提取试剂盒，完成 RNA 的提取。 7.2 恒温核酸扩增 设 50 L恒温核酸扩增反应体系，详见附录 B.2。 7.3 检测 每次反应设置阳性、阴性对照，具体反应程序见表 B.3。 8 结果判定 8.1 结果判读见表 1。 表 1 结果判定 序号 通道 Ct 值 结果判断 1 FAM UNDET 或 40 样本低于检测限，报告为阴性 2 FAM 37 判定 为阳性 3 FAM 37-40 复检一次，如仍为 37-40，则 判定 为阴性 8
9、.2 阴性对照和阳性对照，有任一结果异常，需要重新检测。 8.3 结果参考图谱：见附录 C。 DB37/T 4052 2020 4 A A 附 录 A （规范性附录） 试剂的配制 1 PBS溶液 (pH值 7.4)： a) 磷酸二氢钾 (KH2PO4)： 0.27 g； b) 磷酸氢二钠 (Na2HPO4)： 1.42 g； c) 氯化钠 (NaCl)： 8 g； d) 氯化钾 (KCl)： 0.2 g。 加灭菌水约 800 mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调 pH值至 7.4，最后定容到 1 L。 DB37/T 4052 2020 5 B B 附 录 B （规范性附录） 恒温核酸扩增引物、反
10、应液体系与反应条件 B.1 恒温核酸扩增引物 见表 B.1。 表 B.1 恒温核酸扩增引物 引物 序列 PRRV-F 5 - ATCCAACTCTCAAGTACAGCGTTACTATGTTTATA -3 PRRV-R 5 - TCCACATCGCTGTCGTCAGATCCATCCTCTCCT -3 PRRV-Probe 5 - GTGAAGAGATTGAAGGACTCGAGGATGCTGAC (FAM-d T) (THF) (BHQ1-d T) CTCGTGGTTCAAGCA-C3 spacer -3 注： F为 FAM荧光基团标记、 T为 THF、 B为 BHQ1粹灭基团标记、 3末端为 C
11、3 Spacer标记。 B.2 恒温核酸扩增体系 见表 B.2。 表 B.2 恒温核酸扩增体系 组分 用量 L DEPC 水 25.4 A Buffer 12.5 10 M PRRV-F 2 10 M PRRV-R 2 10 M PRRV-Probe 0.6 模板 RNA 5 B Buffer 2.5 涡旋混合并离心上述溶液，装有干粉的反应管用移液器上下吹打直至干粉溶解完全并混合均 匀。 DB37/T 4052 2020 6 B.3 恒温核酸扩增反应条件 见表 B.3。 表 B.3 恒温核酸扩增反应条件 反应 条件 反应 温度 39 C 循环 数 40 信号 采集 每 30 s 反应 时间 20 min DB37/T 4052 2020 7 C C 附 录 C （资料性附录） 小反刍兽疫恒温扩增检测结果判读 阴性对照和阳性对照见图 C.1。 图 C.1 阴 性对照和阳性对照 样品检测见图 C.2。 图 C.2 样品检测 _
