1、ICS 65.020.30 B 41 DB37 山东省 地 方 标 准 DB37/T 3989 2020 禽源沙门氏菌快速检测技术 Rapid detection method for avian Salmonella 2020 - 06 - 08 发布 2020 - 07 - 08 实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 3989 2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位：山东农业大学、济南百准生物检验有限公司、泰安市动物疫病预防控制中心。 本
2、标准主要起草人：孙淑红、朱琦、郭龙宗、唐德宏、王方昆、唐辉、张富友、鞠孜敬、崔治中。 DB37/T 3989 2020 II 引 言 沙门氏菌病是由沙门氏菌所引起的急性或慢性疾 病的总称。由鸡白痢沙门氏菌所引起的称为鸡白 痢，由鸡伤寒沙门氏菌引起的称为禽伤寒，由其他有鞭毛能运动的沙门氏菌所引起的禽类疾病则统称为 禽副伤寒。禽沙门氏菌病在世界各地普遍存在，对养禽业的危害性很大。该病同样严重危害我国的养禽 业。可垂直传播和水平传播，造成种蛋孵化率、雏鸡成活率和鸡群生产性能下降等问题。当前，我国种 鸡场主要流行的沙门氏菌血清型是 B群和 D群沙门氏菌。 种禽的净化是防控该病最为有效的方法，国家 为此
3、制定了相关的检测标准，颁布了 GB 4789.4 2016 沙门氏菌检验 方法，但该标准缺少简便、快速的病 原学 PCR检测方法和血清学 ELISA检测方法，鉴于此， 特制定本标准。 DB37/T 3989 2020 1 禽源沙门氏菌快速检测技术 1 范围 本标准规定了禽源沙门氏菌鉴别培养和 PCR检测技术以及种鸡场主要流行沙门氏菌（ B群和 D群沙门 氏菌属）血清学 ELISA检测技术。 本标准适用于各种禽类携带沙门氏菌的检疫、诊断、监测和流行病学调查，也可用于规模化种鸡场 中沙门氏菌病的净化。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本
4、适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4789.4 2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 GB/T 27401 实验室质量控制 规范 动物检疫 NY/T 541 2016 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 试剂和材料 3.1 除另有规定外，所用化学试剂均为分析纯。实验所用水均符合 GB/T 6682 二级水的规定，实验中 人员配置、实验室管理、仪器设备使用、样品实验试剂和废弃物处理等均符合 GB/T 27
5、401 的规定。 3.2 LB 液 体培养基（见附录 A.1）。 3.3 BPW 前增菌液（见附录 A.2）。 3.4 SC 增菌液（见附录 A.3）。 3.5 TTB 增菌液（见附录 A.4）。 3.6 XLD 鉴别培养基（见附录 A.5）。 3.7 电泳缓冲液（见附录 A.6）。 3.8 阳性对照选择鸡白痢沙门氏菌（ CVCC535）、肠炎沙门氏菌（ CVCC3377）作为阳性对照。 3.9 阴性对照选择不含 DNA 模板的灭菌超纯水。 3.10 沙门氏菌（ B 群和 D 群沙门氏菌属） ELISA 检测试剂盒。 4 仪器设备 4.1 4 普通冰箱（温控范围 2 8 ）。 4.2 生化培养
6、箱（温度范围： 5 50 ，温度均匀度： 1 ）。 4.3 二级生物 安全柜。 4.4 PCR 仪。 DB37/T 3989 2020 2 4.5 电泳仪（电压 90 V 120 V）。 4.6 控温摇床（温度范围： 5 50 ）。 4.7 凝胶成像仪。 4.8 高压灭菌锅（灭菌温度： 105 135 ；工作压力： 0.35 MPa）。 4.9 振荡器。 4.10 电子天平（感量 0.001）。 4.11 单道微量移液器（ 2 L、 20 L、 200 L、 1 000 L）。 4.12 8 或 12 道微量移液器（ 10 L）与配套吸头。 4.13 酶标仪。 5 样品采集、储存及运输 5.1
7、 按 NY/T 541 2016 规定进行采样。无菌操作采集疑似沙门氏菌感染禽类的粪便、脏器（匀浆）或 肛拭子等，编号。 5.2 样品采集 和样品处理应戴一次性手套，不得交叉污染。 5.3 采集的样品储存 和运输，按照 NY/T 541 2016 规定进行。 6 鉴别培养和 PCR 检测方法 本实验具体实验操作符合 GB/T 19495.2转基因产品检测 实验室技术要求，样品增菌培养方案按照 GB 4789.4 2016执行。 6.1 鉴别培养 6.1.1 按体积 1:9 比例，取粪便、脏 器 0.5 g 或肛拭子等加入到 4.5 mL 的 BPW 前增菌液试管中，置于 37 摇床中， 220
8、 rpm 培养 10 h 12 h。 6.1.2 取培养后的前增菌液 500 L 分别加入到 4.5 mL SC 和 TTB 增菌液中，置于 37 摇床中， 220 rpm 培养 18 h 24 h。 6.1.3 接种针蘸取培养后的 SC 和 TTB 增菌液，以“之”字形划线于 XLD 鉴别培养基平板，置于 37 培养箱中，培养 24 h 48 h。 6.1.4 鸡白痢沙门氏菌形成的菌落呈无色半透明状，其它沙门氏菌在 XLD 鉴别培养基平板上的形态一 般为黑芯菌落（参见附录 B）。 6.1.5 每个样品挑取 3 5 个疑似菌落，分别加入 500 L 1 000 L LB 液体培养基， 37 摇
9、床中， 220 rpm 培养 6 h 8 h。 6.2 PCR 的检测方法 6.2.1 引物 参照参考文献（张江英等， 2013），合成基于沙门氏菌 fimW基因的一对引物作为沙门氏菌鉴定的通 用引物，引物序列参见附录 C。 6.2.2 PCR 扩增 PCR反应总体积为 25 L，引物为 F1/R1，模板分别为 6.1.5中培养的菌液， PCR反应体 系参见附录 C。 DB37/T 3989 2020 3 PCR反应条件为 94 预变性 5 min， 94 45 s、 50 45 s、 72 60 s，循环扩增 35次，最后 72 延伸 7 min， 4 保存。同时设立阴阳性对照。 6.2.3
10、 PCR 产物电泳 取 8 L样品 PCR扩增产物，进行 1 %的琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，用凝胶成像仪观察结果，拍 照并做好试验记录。 6.3 结果判 定 6.3.1 试验成立条件 阴性对照及空白对照 PCR产物电泳后，无扩增条带；阳性对照 PCR产物电泳后，在 477 bp位置出现一 条特异性的扩增条带，试验结果成立。否则试验不成立。（参见附录 D） 6.3.2 结果判定 检测样品 PCR产物电泳后，仅有大小约 477 bp的特异性条带，则 PCR结果阳性； 检测样品 PCR产物电泳后，无特异性条带，则 PCR结果阴性。 7 沙门氏菌鉴定结果 根据 6.3.2的结果， PCR结果阳性可判
11、定为沙门氏菌阳性； PCR阴性则判定为沙门氏菌阴性。 8 血清 ELISA 检测方法 8.1 试剂的准备 8.1.1 底物试剂：取 1 片底物片放入洁净容 器中，加入 5.5 mL 的底物缓冲液，混合 3 min 直到完全溶 解。 8.1.2 洗液的配制：将一小袋洗液完全倒入 1 L 水中（或称取所需的用量，进行对应的稀释），使用 时务必完全溶解，洗液可在 4 保存 1 个月。 8.1.3 试剂盒其它成分可以直接使用，使用前要回温至室温（ 22 27 ）。 8.2 操作过程 8.2.1 取出包被板，记录样品的位置；在 A1、 A2 位置的两孔加入阴性对照，在 A3、 A4 位置的两孔加 入阳性
12、对照。 8.2.2 在剩余的孔内分别加入一定量的稀释好的被检样品，样品可采用双孔检测也可采用单孔检测。 8.2.3 盖好反应盖板，在生化培养箱内 22 27 孵育 30 min。 8.2.4 用 300 L 350 L 配制好的洗液洗涤板孔，重复 3 5 次，此步骤可用洗板机也可用手洗， 最后一次洗板后将液体拍干。 8.2.5 每孔加入 100 L 酶标二抗。盖好反应板，在生化培养箱内 22 27 孵育 30 min。 8.2.6 重复步骤 8.2.4。 8.2.7 每孔加入 100 L 底物溶液，在生化培养箱内 22 27 避光孵育 15 min。 8.2.8 每孔加入 100 L 终止液。
13、 8.2.9 用酶标仪测量吸光度并且记录样品和对照的吸光度。 DB37/T 3989 2020 4 8.3 结果判定 8.3.1 试验成立的条件：按 ELISA 检测试剂盒质控标准进行。 8.3.2 结果判定：按 ELISA 检测试剂盒 规定进行。 8.3.3 病原阴性场的血清学 ELISA 检测阳性率标准参见附录 E。 DB37/T 3989 2020 5 A A 附 录 A （规范性附录） 培养基配制 A.1 LB液体培养液 A.1.1 成分 胰蛋白胨 5 g 酵母提取粉 10 g 氯化钠 10 g 水 1 000 mL A.1.2 制备 将各成分加入水中 ，搅混均匀， 121 高压灭菌
14、15 min。 A.2 BPW前增菌液 A.2.1 成分 蛋白胨 10.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸氢二钠 (Na2HPO412H2O) 9.0 g 磷酸二氢钾 1.5 g 水 1 000 mL A.2.2 制备 将各成分加热溶解于 1 000 mL水中， 121 高压灭菌 15 min备用。 A.3 SC增菌液 A.3.1 成分 蛋白胨 5.0 g 乳糖 4.0 g 亚硒酸氢钠 4.0 g 磷酸氢二钠 10.0 g L-胱氨酸 0.01 g 水 1 000 mL A.3.2 制备 DB37/T 3989 2020 6 将各成分加热溶解于 1 000 mL蒸馏水中，无菌操作分装于灭菌三角瓶
15、或试管中备用。当天制备当天 使用，无需高压灭菌。 A.4 TTB增菌液 A.4.1 成分 蛋白胨 9.0 g 牛肉粉 4.5 g 氯化钠 2.7 g 碳酸钙 40.5 g 胆盐 5.0 g 硫代硫酸钠 50.0 g 水 1 050 mL A.4.2 制备 将各成分溶解于 1 050 mL蒸馏水中，加热煮沸，临用前加入 20 %碘液 20 mL， 0.1 % 煌绿 10 mL， 现配现用，不宜久置。 A.5 XLD鉴别培养基 A.5.1 成分 酵母浸粉 3.0 g L-赖氨酸 5.0 g 木糖 3.75 g 乳糖 7.5 g 蔗糖 7.5 g 柠檬酸铁铵 0.8 g 硫代硫酸钠 6.8 g 氯化
16、钠 5.0 g 苯酚红 0.08 g 琼脂 13.0 g 水 1 000 mL pH 7.4+/- 0.2 25 A.5.2 制备 将上述成分加热溶解于 1 000 mL蒸馏水中，冷至 50 左右时，倾入无菌平皿，备用。 A.6 TAE电泳缓冲液 A.6.1 成分 Tris-乙酸 40 mmol/L DB37/T 3989 2020 7 EDTA（ pH 8.0） 1 mmol/L A.6.2 制备 将 50倍 TAE电泳浓缩缓冲液用蒸馏水 50倍稀释即可。 DB37/T 3989 2020 8 B B 附 录 B （资料性附录） 沙门氏菌在 XLD 培养基上菌落形态图 沙门氏菌在 XLD培养
17、基上菌落形态图见图 B.1。 A B 说明： A 有黑色中心的菌落； B 无色半透明菌落。 图 B.1 沙门氏菌在 XLD 培养基上菌落形态图 DB37/T 3989 2020 9 C C 附 录 C （资料性附录） 引物序列和 PCR 反应体系 沙门氏菌鉴定引物序列见表 C.1。 表 C.1 沙门氏菌鉴定引物序列 引物名称 引物序列 片段大小 fimW F 5-AACAGTCACTTTGAGCATGGGTT-3 477bp R 5-GAGTGACTTTGTCTGCTCTTCA-3 PCR反应体系见表 C.2。 表 C.2 PCR 反应体系 组分 体积 (L) 水 10.5 2Mix 12.5
18、 F1 (25 moL/L) 0.5 R1(25 moL/L) 0.5 Template 1 （菌液） Total 25 DB37/T 3989 2020 10 D D 附 录 D （资料性附录） PCR 检测结果电泳图 PCR检测结果电泳图见图 D.1。 说明： M为 DNA Marker DL； 1-5为阳性； + 为阳性对照； - 为阴性对照。 图 D.1 PCR 检测结果电泳图 DB37/T 3989 2020 11 E E 附 录 E （资料性 附录） 血清学阳性率标准 用于病原阴性场血清学 ELISA检测阳性率标准设定。 依据血清学 ELISA检测结果，阳性率 3 %认定为沙门氏菌净化示范场判定标准，阳性率 5 %认定 为沙门氏菌净化创建场的血清学的判定标准。 _
