1、ICS 11.220 B 41 DB37 山东省 地 方 标 准 DB37/T 3997 2020 细菌耐药基因 blaNDM常见亚型的环介导等温 扩增检测技术 Loop-mediated isothermal amplification detection technique for common subtypes of bacterial resistance gene blaNDM 2020 - 06 - 08 发布 2020 - 07 - 08 实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 3997 2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准
2、由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所、山东润达检测 技术有限公司。 本标准主要起草人：齐静、刘玉庆、杜以军、李璐璐、胡明、骆延波、张庆、张印、赵效南、任金 瑞、刘军伟、王怀中、陶海英。 DB37/T 3997 2020 1 细菌 耐药基因 blaNDM常见亚型的环介导等温扩增检测技术 1 范围 本标准规定了细菌耐药基因 blaNDM常见亚型（ blaNDM-1、 blaNDM-4、 blaNDM-5和 blaNDM-9）的环介导等温扩增 LAMP（ Loop-Mediated Isothermal A
3、mplification）检测技术的操作步骤。 本标准适用于实验室及临床样本的细菌耐药基因 blaNDM常见亚型（ blaNDM-1、 blaNDM-4、 blaNDM-5和 blaNDM-9） 的快速可视化检测，其他几个亚型的检测可以参考使用。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方 法 GB/T 16489 水质 硫化物的测定 亚甲基蓝分光光度法 3 试验原理 本标准所应用的试验原理为：根据序列保守区域
4、设计一对外引物、一对内引物和一对环引物特异性 识别靶序列 上六 个独立区域，在 Bst DNA聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，大量合成目标 DNA的同 时伴随有副产物焦磷酸镁白色沉淀产生，可以实现恒温扩增和快速检测，结果通过肉眼即可判定。 4 试剂或材料 除非特别规定所用试剂均用分析纯水：符合国标 GB/T 6682一级水的规定。 4.1 Bst DNA 聚合酶。 4.2 0.5 TBE 缓冲液：配制见附录 A.2。 4.3 2 %琼脂糖电泳液：配制见附录 A.3。 4.4 无毒核酸染料。 4.5 DNA Marker 2000。 4.6 商品化的细菌基因组 DNA 提取试剂盒。 4.7
5、引物： blaNDM基因几个国内常见亚型的 LAMP 检测 引物如下： 外引物 F3： 5 -GGCCACACCAGTGACAAT-3； 外引物 B3： 5 -GCGGAATGGTCATCACGAT-3； 内引物 FIP： 5 -ACTTGGCCTTGCTGTCCTTGATGTTGGGATCGACGGCAC-3； 内引物 BIP： 5 -CGCTCGGCAATCTCGGTGATGCTGGCCTTGGGGAACGC-3； 环引物 LF： 5 -GCTGTAGCGAAAACCACCG-3； 环引物 LB： 5 -ACACTGAGCACTACGCCG-3。 DB37/T 3997 2020 2 5
6、仪器设备 5.1 微量移液器： 10 L、 20 L、 100 L、 1 000 L。 5.2 低温高速离心机：离心力 20 000 g。 5.3 电热恒温水浴锅。 5.4 稳流稳压电泳仪。 5.5 水平电泳槽。 5.6 凝胶成像系统。 5.7 电子分析天平：精度 0.001 g。 6 试验步骤 6.1 样品 在生物安全柜中，将采集的样品（如人或动物的肛拭子、鼻拭子或肝脏、脾脏、脑等不同脏器组织 等）无菌划线特异性筛选培养基或哥伦比亚血琼脂培养基，置 37 培养箱过夜培养 12 h 18 h，获得 细菌单菌落，经二次纯化后，挑取单菌落于 BHI营养肉汤中过夜培养 12 h 18 h，用于提取细
7、菌基因组 DNA。 6.2 DNA 的提取 收集过夜培养的待检细菌菌液 1 mL（菌液浓度的 OD600值大于 1.0）到 1.5 mL的 EP管中， 12 000 g离 心 2 min，彻底弃上清，取沉淀用商品化的细菌基因组 DNA提取试剂盒提取细菌基因组总 DNA，最后溶于 50 L灭菌水中，测定 DNA的浓度， -20 保存备用。 6.3 反应体系 反应体系见表 1。 表 1 环介导等温扩增 LAMP 反应体系 1 2 等温缓冲液 (RM) 12.5 L 2 外引物 B3/F3(100 M ) 0.1 L2 3 内引物 BIP/FIP(100 M) 0.4 L2 4 环引物 LF/LB
8、(100 M) 0.2 L2 5 Bst DNA 聚合酶 1.0 L 6 细菌基因组 DNA 2.0 L 7 灭菌水 8.1 L 其中： 2等温反应缓冲液 RM含有 40 mM pH为 8.8的 Tris-HCl、 20 mM KCl、 16 mM MgSO4、 20 mM（ NH4） 2SO4、 0.2wt% Tween20、 1.6 M甜菜碱、 2.8 mM dNTP。 6.4 扩增 检测 blaNDM基因的 LAMP反应体系，包括若干个装有反应液的 LAMP反应管（ 25 L/管），在每个 LAMP 反应管内设置 LAMP反应体系，详见表 1。每次 LAMP反应均应设置 1管为阳性对照，
9、加入 1.0 L含有细菌 blaNDM-1基因的洛菲不动杆菌基因组 DNA（ 300 ng/ L）；设置 1管为阴性对照，加入 1.0 L的灭菌水取 代细菌基因组 DNA。 DB37/T 3997 2020 3 将上述 LAMP反应管轻轻混匀后，置恒温水浴锅中进行扩增，如果选择荧光目视检测，可以选择在表 1步骤 5之后每个 LAMP反应管中添加 1.0 L钙黄绿素，相应地整个 25 L体系中减少 1.0 L灭菌水，再 加入相应地细菌基因组 DNA，轻轻混匀后，置恒温水浴锅中进行扩增，具体 参数见表 2。 表 2 LAMP 反应程序设定 步骤 温度 时间 功能 1 65 40 min 恒温扩增
10、2 80 5 min 灭活酶处理 试验过程注意事项： LAMP反应产物极易产生气溶胶污染，是 LAMP研究中首要避免的因素之一。控制气溶胶污染的解决方 法为： 1、对核酸提取和扩增进行严格分区， 2、反应全程禁止开启反应管。 3、配置 LAMP反应体系尽量 在冰上进行，操作 Bst DNA聚合酶时不能用涡旋振荡器过激搅拌，避免酶的失活，应该使用轻轻弹击反 应管或颠倒混匀的方式进行，操作过程尽量避免产生气泡。 7 结果分析和 判定 7.1 感官结果分析和判定 7.1.1 反应结束后，观察反应管内液体的颜色和状态，如果底部出现与阳性对照一样的白色沉淀为阳 性结果（参见附录 B：图 1A 泳道 1
11、所示），如果不出现白色沉淀为阴性结果（参见附录 B：图 1A 泳道 2）。 7.1.2 如果在扩增反应前，每个反应管中加入 1.0 L 钙黄绿素，反应结束后扩增产物变为与阳性对 照一样的绿色为阳性结果（参见附录 B：图 1A 泳道 3），橙色的为阴性结果（参见附录 B：图 1A 泳道 4）。 7.2 电泳结果分析和判定 7.2.1 2 %琼脂糖凝胶板的制备（参见附录 A.3） 称取 2.0 g琼脂糖，加入 100 mL 0.5 TBE缓冲液（参见附录 A.2）中，加热融化，温度降低至 55 后加入 1 %的无毒核酸染料，倒入电泳槽中冷却待用。 7.2.2 加样 将 LAMP扩增产物 5 L与
12、1 L 6 Loading Buffer混合，点样于 2 %琼脂糖凝胶孔中，以 DNA Marker 2000作相对分子质量指示。每次电泳至少加 1孔阳性和 1孔阴性的扩增产物作对照。 7.2.3 电泳及结果判定 保持稳定电压 80 V，电泳 20 min，电泳反应结束后，在阳性和阴性对照成立的情况下，出现瀑布样 条带的泳道判为阳性，说明待测样品中含有超级细菌 blaNDM基因（参见附录 B：图 1B泳道 1和 3），不出现 瀑布样条带的为阴性（参见附录 B：图 1B泳道 2和 4）。 DB37/T 3997 2020 4 A A 附 录 A （规范性附录） 试剂的配制 A.1 10 TBE缓
13、冲液 三羟甲基氨基甲烷（ Tris） 108 g 乙二胺四乙酸（ Na2EDTA.2H2O） 7.44 g 硼酸 （ Boric acid） 55 g 灭菌水 1 L pH调至 8.3 A.2 0.5 TBE缓冲液 取 10 TBE缓冲液 25 mL，加灭菌水 475 mL，制成 0.5 TBE的工作液。 A.3 2 %琼脂糖电泳液 琼脂糖 2.0 g 0.5TBE缓冲液 100 mL DB37/T 3997 2020 5 B B 附 录 B （资料性附录） LAMP 反应管阳性和阴性扩增产物可视化和电泳结果 说明： A 泳道 1代表扩增产物中出现底部的白色沉淀，阳性；泳道 2代表扩增产物中无白色沉淀，阴性；泳道 3代表 扩增产物中液体呈绿色，阳性；泳道 4代表 扩增产物中液体呈橙色，阴性； B 泳道 1和 3代表扩增产物呈瀑布样条带，阳性；泳道 2和 4代表扩增产物无特异性条带，阴性。 图 B.1 LAMP 反应管阳性和阴性扩增产物可视化和电泳结果 _
