1、 ICS65.120 DB37 B20 山东省地方标准 DB37/T 6652007 饲料中苏丹红的测定 高效液相色谱法 Determination of Sudan in feeds by HPLC 2007-03-09 发布 2007-05-01 实施 山东省质量技术监督局 发布 DB37/T 6652007 I 前 言 本标准的附录 A 为资料性附录。 本标准由山东省畜牧办公室提出。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省饲料监察所。 本标准主要起草人：李俊玲、李桂华、李会荣、朱良智、战余铭、杨志强。 DB37/T 6652007 1 饲料中苏丹红的测定 高效
2、液相色谱法 1 范围 本标准规定了高效液相色谱测定饲料中苏丹红的方法。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料及添加剂预混合饲料中苏丹红的测定。 本标准最低定量限苏丹红、苏丹红为1mg/kg，苏丹红、苏丹红为0 .5mg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的 修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 20195 动物饲料 试样的制备 3
3、原理 试料中苏丹红用乙腈提取、过膜后，在高效液相色谱反相柱上分离，紫外检测器310nm处测定，用 二极管阵列检测器确证。 4 试剂 除非另有说明，在分析中仅使用分析纯的试剂，水符合GB/T 6682一级水的规定。 4.1 乙腈。 4.2 乙腈，色谱纯。过 0.45m 有机滤膜。 4.3 三氯甲烷，色谱纯。 4.4 HPLC 流动相：乙腈（4.2）水95050，混匀。用前超声脱气 5min10min。 4.5 苏丹红标准贮备液 准确称取苏丹红对照品（含量为96.7%）0.013g、苏丹红对照品（含量为83.3%）0.015g、苏丹 红对照品（含量为91.3%）0.014g、苏丹红对照品（含量为7
4、5.5% ）0.016g，分别于25mL容量瓶中， 苏丹红、苏丹红用乙腈(4.2)溶解并定容，苏丹红、苏丹红均先用少量三氯甲烷(4.3)溶解，再 用乙腈定容。其浓度分别为500g/mL。避光操作。 4.6 苏丹红标准工作液 分别准确移取苏丹红、苏丹红、苏丹红、苏丹红的标准贮备液(4.5)5.00mL于同一50 mL 容量瓶中，用乙腈定容。该溶液浓度为50g/mL。现用现配。 5 仪器 5.1 分析天平：感量 0.1mg。 5.2 超声波清洗器。 5.3 振荡器。 5.4 离心机：5000r/min。 5.5 旋涡混合器。 5.6 高效液相色谱仪：具有C 18柱、紫外检测器和二极管阵列检测器。
5、DB37/T 6662007 2 6 试样的制备 按GB/T 20195规定执行。 7 分析步骤 7.1 提取 称取适量试料(配合饲料、浓缩饲料 5g，添加剂预混合饲料 2g)精确至 0.1mg，置于 50mL离心管中， 准确加入乙腈（4.1）25mL，振摇使试料全部润湿，于旋涡混合器（5.5）上混合 1 min 后，放在振荡器 （5.3） 上振荡提取 60min。 振荡结束后，再于旋涡混合器 （5.5） 上混合1min， 于离心机 （5.4） 上 5000r/min 离心 5min。取上清液适量过 0.45m 有机滤膜，待测。 对于含苏丹红较高的浓缩饲料和添加剂预混合 饲料，可先取适量上清液
6、，用乙腈（4.2）稀释，使 试样溶液中苏丹红最终浓度为0.2g/mL10g/mL。 7.2 标准系列 准确移取标准工作液(4.6) 0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、5.00 mL、10.00mL，用乙腈（4.2） 稀释至50mL。 该标准系列中苏丹红、苏丹红、苏丹红、 苏丹红的相应浓度分别为: 0.20g/mL 、 0.50g/mL、1.00g/mL 、2.00g/mL、5.00g/mL、10.00g/mL。现用现配。 7.3 色谱参考条件 色谱柱：C 18柱，25cm4.6mm,id，5m 。 柱温:室温。 流动相:乙腈+水=950+50。 流速: 1.0mL
7、/min。 检测器: 紫外检测器，二极管阵列检测器。 检测波长: 310nm。 扫描范围：200nm600nm。 进样量: 20L。 7.4 测定 7.4.1 标准曲线的绘制 将上述标准系列（7.2）从低浓度到高浓度分别注入高效液相色谱仪，以苏丹红的浓度为横坐标， 峰面积为纵坐标，分别绘制苏丹红、苏丹红、苏丹红和苏丹红的工作曲线，并计算回归方程。 7.4.2 试样测定 将待测液注入高效液相色谱仪，据保留时间定性，以峰面积定量。 7.4.3 确证 除用保留时间定性外，还应用二极管阵列检测器测定苏丹红、苏丹红、苏丹红和苏丹红在 200nm-600nm区间的特征光谱 , 苏丹红在230nm、310n
8、m、478nm处，苏丹红在230nm、310nm、49 0nm 处，苏丹红在230nm、344nm、504nm处，苏丹红在2 30nm、348nm、516nm处，均有吸收峰，试样溶液 与标准溶液的吸收曲线无明显差异，均具有上述特征峰，且不同吸收峰的比值试样溶液与标准溶液一致。 8 结果计算 试样中苏丹红的含量以质量分数 X计，数值以毫克每千克（mg/kg）表示，按公式(1)计算： c V X (1) m 式中: c试料色谱峰面积对应的苏丹红的浓度的数值，单位为微克每毫升（g/mL ）； V加入提取液的总体积的数值，单位为毫升（mL）； DB37/T 6652007 3 m 试料的质量的数值，单
9、位为克（g）。 计算结果表示到三位有效数字。 9 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于两个测定值的算术平均值的10， 以大 于这两个测定值的算术平均值的10%情况不超过5为前提。 DB37/T 6662007 4 附 录 A （资料性附录） 特征光谱图和混合标准样品图谱 图A.1给出了苏丹红的二极管阵列特征光谱图 图 A .1 苏丹红的二极管阵列特征光谱图 图A.2 给出了苏丹红的二极管阵列特征光谱图 图A .2 苏丹红的二极管阵列特征光谱图 图A.3 给出了苏丹红的二极管阵列特征光谱图 图 A.3 苏丹红的二极管阵列特征光谱图 图A.4 给出了苏丹红的二极管阵列特征光谱图 图A. 4 苏丹红的二极管阵列特征光谱图 图 A.5 给出了苏丹红混合标准样品图谱 图 A.5 苏丹红混合标准样品图谱
