1、 ICS 65.120 DB37 B20 山东省地方标准 DB37/T 6672007 饲料中喹乙醇的测定 液相色谱质谱联用法 Determination of olaquindox in feeds by LC-MS 2007-03-09 发布 2007-05-01 实施 山东省质量技术监督局 发布 DB37/T 6672007 I 前 言 本标准的附录A、附录B均为资料性附录。 本标准由山东省畜牧办公室提出。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省饲料监察所、农业部饲料效价与安全监督检验测试中心（北京）。 本标准主要起草人：梁萌、杨文军、汤文利、任爱丽、孙延军。
2、 DB37/T 6672007 1 饲料中喹乙醇的测定 液相色谱质谱联用法 1 范围 本标准规定了用高效液相色谱-质谱联用（LC-MS）测定饲料中喹乙醇的方法。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料中喹乙醇的测定。 本标准高效液相色谱的最低定量限为1mg/kg，质谱确证限为1mg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的 修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 6682
3、 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 20195 动物饲料 试样的制备 3 原理 饲料样品中的喹乙醇用甲醇溶液提取，过滤后用反相液相色谱柱分离，紫外检测器检测，外标法定 量。并采用质谱检测器以喹乙醇的质量色谱峰保留时间和特征离子进行确证。 4 试剂 除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂。水符合 GB/T 6682 一级水的规定。 4.1 甲醇，色谱纯。 4.2 乙酸溶液，体积分数是 0.1%。 4.3 碳酸钾。 4.4 提取液：甲醇+水=5+95。 4.5 高效液相色谱流动相：甲醇（4.1）+水，采用二元梯度洗脱。 4.6 液质联用流动相：甲醇（4.1）+乙酸溶液（4.2），采用二元梯度
4、洗脱。 4.7 淋洗液 1：盐酸 c(HCl)=0.1mol/L ,移取 8 .33 mL 盐酸至1000mL 容量瓶中，定容。 4.8 淋洗液 2：盐酸 c(HCl)=0.02mol/L，移取 200mL淋洗液 1（4.7）至 1000mL 容量瓶中，定容。 4.9 淋洗液 3：甲醇（4.1）+水=5+95。 4.10 洗脱液：甲醇（4.1）+水=40+60。 4.11 喹乙醇标准液 4.11.1 喹乙醇标准贮备液 称取喹乙醇标准品 0.050g，精确到 0.1mg（含量99.6%），于 50ml 棕色容量瓶中，加入适量洗脱 液（4.10），超声 15min 溶解，冷却至室温后定容，摇匀，贮
5、存于-18冰箱中避光保存，有效期为一 个月。 4.11.2 喹乙醇标准工作液 准确移取适量标准储备液（4.11.1）于容量瓶中，用洗脱液（4.10）定容，依次配制成 0.1 g/mL、 1.0g/mL、10.0 g/mL、50.0 g/mL、100.0 g/mL 的标准工作溶液。现用现配。 5 仪器 DB37/T 6672007 2 5.1 高效液相色谱仪：具紫外检测器。 5.2 离子阱质谱仪。 5.3 离心机：3500r/min。 5.4 具塞塑料离心管：100mL。 5.5 固相萃取小柱：HLB 3CC 60mg。 5.6 超声波振荡器。 5.7 固相萃取仪。 5.8 恒温振荡器。 6 试
6、样的制备 按GB/T 20195规定执行。 7 分析步骤 7.1 提取 称取约 5g 试样，精确到 0.1mg，于具塞锥形瓶中，加入 0.5g 碳酸钾（4.3），加入 50.00mL 提取 液（4.4），具塞置入恒温振荡器中，避光振荡 45min（振荡速度 11 0r/min）。提取液在 3500r/min 下 离心 10min，上清液经滤纸过滤后保留滤液 A，用于固相萃取净化。 7.2 HLB 小柱的活化 依次用 2mL甲醇（4.1）和 2mL 水对HLB 小柱(5.5)进行活化。 7.3 净化 将混匀的滤液 A（7.1）2mL 加入活化好的 HLB 小柱（7.2），分别用 3mL淋洗液 2
7、（4.8）、淋洗液 1（4.7）和淋洗液 3（4.9）淋洗小柱，并将小柱吹干。最后用 2.00mL 洗脱液（4.10）洗脱，收集洗脱 液，摇匀，过 0.2m 滤膜后待测。 对于含喹乙醇较高的试样，调整洗脱液（4.10）用量，使试样溶液中喹乙醇最终浓度为 5.0g/mL -10.0g/mL。旋涡混匀，过 0.2m微孔滤膜，待测。 7.4 测定 7.4.1 色谱参考条件 色谱柱:C 18柱，250mm4.6mm，id，5m，或性能类似分析柱。 柱温：室温。 检测器：紫外检测器，检测波长260nm。 流动相：按表1执行。 表1 液相色谱流动相梯度洗脱程序 时间， min 水，% 甲醇，% 0 85
8、15 7 85 15 10 30 70 14 30 70 18 85 15 25 Stop 流速：1mL/min。 进样体积：20L。 DB37/T 6672007 3 7.4.2 定量 用紫外检测器测定标准工作液（4.11.2）和洗脱液（ 7.3）中喹乙醇峰面积的响应值，用多点校准 法定量。 7.5 确证 7.5.1 质谱参考条件 色谱柱:C 18柱，250mm4.6mm，id，5m，或性能类似分析柱。 流动相：按表2执行。 表2 质谱流动相梯度洗脱程序 时间， min 0.1%乙酸溶液，% 甲醇，% 0 85 15 7 85 15 10 30 70 14 30 70 18 85 15 25
9、 Stop 流速：0.2mL/min。 进样量：20L。 离子模式：正离子化，大气压电离源（APCI+）。 喹乙醇选择离子： m/z 264、246、221、177。 雾化气压力：60.0psi。 干燥气流速：5.0L/min。 干燥气温度：350。 毛细管出口电压：4000V。 喷雾器温度：350。 离子电荷控制（ICC）:on。 7.5.2 确证 通过样品总离子流色谱图上喹乙醇（ m/z 264、 m/z 246、 m/z 221、 m/z 177）的保留时间和对应的 特征离子与标准品相应的保留时间和对应的特征离子进行对照确证。样品相对峰度比与标准品相对峰度 比相差不大于30%。 8 测定
10、结果的计算 试样中喹乙醇的含量以质量分数 X计，数值以毫克每千克（mg/kg）表示，按公式（1）计算； A V 1V 2 X = (1) mV 3 式中： A地西泮色谱峰的峰面积对应的含量的数值，单位为微克每毫升（g/mL）； V1加入提取液的体积的数值，单位为毫升（mL）； V2洗脱液的体积的数值，单位为毫升（mL）； DB37/T 6672007 4 m试料的质量的数值，单位为克（g）； V3移取提取液上HLB小柱的体积的数值，单位为毫升（mL）。 计算结果表示到三位有效数字。 9 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于两个测定值的算术平均值的7，以大 于这两个测定值
11、的算术平均值的7%情况不超过5为前提。 DB37/T 6672007 5 附录 A （资料性附录） 喹乙醇特征离子 表 A.1 给出了喹乙醇确证方法的特征离子 表 A.1 喹乙醇确证方法的特征离子 特征离子 （ m/z） 264 246 221 177 结构式 M+H + (M+H-H2O) + (M+H- CHNO) + (M+H- C3H6NO2) + DB37/T 6672007 6 附录 B （资料性附录） 喹乙醇质谱图 图B.1给出了喹乙醇的质谱图 图B.1 喹乙醇质谱图 176.8 247.8 263.8 1. +MS, 5.5-6.0min (#590-#628) 159.7 176.7 211.7 220.7 228.8 245.7 1. +MS2(263.8), 5.6-6.0min (#591-#629) 0 1 2 3 4 5 6 x10 Intens. 0 1 2 3 4 5 6 5 x10 100 150 200 250 300 350 m/z
