1、ICS 65.150 B 50 DB37 山东省 地方标准 DB37/T 4058 2020 水生动物细菌性病原检测技术规范 Inspection protocol for bacterial pathogens of aquatic animals 2020 - 07 - 09 发布 2020 - 08 - 09 实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 4058 2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施。 本标准由山东省渔业标准化
2、委员会（鲁 TC03）归口。 本标准起草单位：威海海洋职业学院、山东省渔业技术推广站、中国科学院水生生物研究所、江苏 省渔业技术推广中心、 威海市渔业技术推广站。 本标准主要起草人：侯仕营、刘朋、刘晓燕、李爱华、董济军、刘缵延、吴亚锋、马湘君、尹相菡、 刘振华。 DB37/T 4058 2020 1 水生动物细菌性病原检测技术规范 1 范围 本标准规定了水生动物细菌性病原（ Bacterial pathogens of aquatic animals）检测的试剂与材 料、仪器设备、采样、细菌性病原分离培养和病原菌检测。 本标准适用于山东省水生动物常见细菌性病原检测。 2 规范性引用文件 下列文
3、件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用 文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4789.28 食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求 SC/T 7014 2006 水生动物检疫实验技术规范 SC/T 7201.1 鱼类细菌病检疫技术规程 第 1部分：通用技术 SN/T 2123 出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范 3 试剂与材料 试剂与材料应符合 GB 4789.28和附录 A的规定。 4 仪器设备 按照 SC/T 7201.1的规定执行。 5 采样 5.1 采样用具 应使用无菌采
4、样用具。 5.2 采样数量、个体要求、采集部位 按照 SC/T 7014 2006中第 6章的规定执行。 5.3 样品运输及保存 按照 SN/T 2123的规定执行。 6 细菌性病原分离培养 6.1 分离培养 DB37/T 4058 2020 2 6.1.1 兼性厌氧菌和需氧菌的分离培养 规范取样后，采用稀释倒平板法、涂布平板法、平板划线法等方式，在 28 30 培养 24 h；低 温下取样应在 15 18 同步培养 24 h。 6.1.2 厌氧菌的分离培养 将处理好的平板置于玻璃干燥器，并在其上方放置连二亚硫酸钠和无水碳酸钠（分别研细均匀，临 用前混合置于一平皿内）各 30 g/1 000
5、mL容积，然后将干燥器盖严，用凡士林密封，在 28 30 培 养 24 h；低温下取样则应在 15 18 同步培养 24 h。 严格厌氧菌的分离培养应在厌氧工作台中进行。 6.2 纯培养 6.2.1 兼性厌氧菌和需氧菌的纯培养 挑取单菌落，接种于相应培养基上，按照 6.1.1的方法培养。 6.2.2 厌氧菌的纯培养 挑取单菌落，接种于相应培养基上，按照 6.1.2的方法培养。 6.3 多次纯培养 若经过纯培养后，未能得到形态特征基本一致的单菌落，可进行多次纯培养，直到获得形态特征基 本一致的单菌落，操作步骤应符合 6.2的要求。 7 病原菌检测 7.1 病原菌 16S rDNA 序列分析 7.
6、1.1 菌落 PCR 按照附录 B执行。 7.1.2 结果 判定 7.1.2.1 PCR 结果可靠 DNA Marker标准样品出现清晰的梯度条带，阳性对照可见 1472 bp左右 DNA条带，且阴性和空白对照 样品无条带出现，则 PCR实验结果可靠，可进行样品分析。 7.1.2.2 电泳失败 DNA Marker标准样品未出现条带，则电泳失败，应检查电泳试剂重新进行电泳。 7.1.2.3 检测结果无效 DNA Marker标准样品出现清晰的梯度条带，阳性对照无条带或者 DNA条带非 1472 bp左右，或者在阴 性对照和空白对照样品中出现了 DNA条带，则试验结果无效，应重新进行 PCR扩增
7、。 7.1.3 克隆、测序和比对 DB37/T 4058 2020 3 将 7.1.2样品扩 增条带克隆、测序，序列输入到 NCBI网站进行比对，确定细菌的属种。 7.2 病原菌生化特性检测 按照 SC/T 7014 2006中的 9.4规定执行。 7.3 结果综合判定 需要鉴定病原菌到属依据 7.1.3结果进行判定，需要进一步鉴定到种应结合 7.2结果进行综合判定。 DB37/T 4058 2020 4 A A 附 录 A （规范性附录） 试剂的配制 A.1 TE缓冲液 A.1.1 A液： 1 mol/L Tris HCl(pH8.0) 称取 Tris碱 6.06 g，加去离子水 40 mL
8、溶解，滴加浓 HCl约 2 mL调 pH至 8.0，定容至 50 mL。 A.1.2 B液： 0.5 mol/L EDTA(pH8.0) 称取 Na2EDTA 2H2O 9.31 g，加超纯水 35 mL，剧烈搅拌，用约 1 g NaOH颗粒调 pH至 8.0，定容至 50 mL （ Na2EDTA 2H2O需加入 NaOH将 pH调至接近 8.0时才会溶解）。 A.1.3 TE缓冲液 量取 A液 5 mL， B液 1 mL于烧杯中，加 400 mL去离子水混合，调 pH至 8.0，定容至 500 mL。 A.2 1 TAE缓冲液 称取 Tris 242.0 g， Na2EDTA 2H2O 3
9、7.2 g于 1 L烧杯中，加 800 mL去离子水充分搅拌溶解，再加入 57.1 mL醋酸，充分混匀。最后以去离 子水定容至 1 000 mL即为 50 TAE缓冲液，使用时稀释 50倍即可。 DB37/T 4058 2020 5 B B 附 录 B （规范性附录） 菌落 PCR 测定 B.1 制备 DNA模板 用无菌牙签挑取单个菌落到 0.2 mL PCR管中，加入 10 L无菌 1 TE（见附录 A.1）缓冲液弹击混匀， 标记，盖紧， 100 煮沸 5 min， -20 冷冻 5 min（循环 2次）， 5 000 r/min离心 1 min，取上清液检测 DNA 模板浓度，用于后续 P
10、CR扩增。当样本量少时也可采用合适的试剂盒制备 DNA模板。 B.2 PCR扩增 采用 50 L PCR反应体系： DNA模板浓度范围为 0.2 ng/ L 2 ng/ L，（用核酸测定仪测定 DNA模 板浓度，根据浓度值计算模板添加体积）， 10 PCR Buffer（含 Mg2+ 1.5 mM） 5 L， dNTP（ 10 mM） 1 L，上游引物（ 27F）： 5 AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3，下游引物（ 1492R）： 5 TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T 3（ 25 M）各 2 L， Taq酶（ 2 U/ L） 1 L 2 L，去
11、离子水补至 50 L，混匀， 稍离心。 反应管置于 PCR仪中，首先 95 预变性 5 min；主循环 30次： 94 30 s， 50 退火 30 s， 72 30 s （时间可根据片段长度调整）；终延伸 72 10 min， 4 保存。 注： 不同细菌 PCR程序可不同。 B.3 电泳检测 设置阳性样品对照（如大肠杆菌 DNA）、阴性样品（如鱼的基因组 DNA或细菌质粒 DNA）对照、空白 对照（无 DNA）。 1 TAE（见附录 A.2）缓冲液配置含核酸染料的 2 %琼脂糖凝胶， PCR扩增产物与 6上 样缓冲液混合，同时以 DL2000或同等大小的 DNA Marker标准样品为对照。 10 V/cm电泳 30 min，凝胶成像 系统拍摄电泳结果。 _
