1、ICS 65.020 B 16 DB37 山东省 地 方 标 准 DB 37/T 3893 2020 芋头病毒检测技术规程 Detection and identification of taro viruses 2020 - 03 - 31 发布 2020 - 05 - 01 实施 山东省 市场监督管理局 发布 DB 37/T 3893 2020 I 前 言 本标准由山东省农业农村厅提出。 本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院植物保护研究所。 本标准主要起草人：姜珊珊、辛相启、吴斌、张眉、王升吉、辛志梅。 DB 37/T 3893 2020 1 芋头病毒
2、检测技术规程 1 范围 本标准规定了芋花叶病毒（ Dasheen mosaic virus， DsMV）和黄瓜花叶病毒（ Cucumber mosaic virus， CMV）的 RT-PCR的检测方法。 本标准适用于芋头叶片中芋花叶病毒和黄瓜花叶病毒的检 测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 检测对象 3.1 芋花叶病毒 中文名：芋花叶病毒 学名： Dasheen mosaic virus 缩
3、写： DsMV 分类地位： 马铃薯 Y病毒科 （ Potyviridae）， 马铃薯 Y病毒 属（ Potyvirus） 病毒粒子、传播途径及危害：病毒粒子呈线状，长度约为 750 nm。一般通过蚜虫传播，还可 通过机 械摩擦传播。感染 DsMV的芋头植株通常表现为叶片花叶、斑驳、皱缩卷曲、叶脉黄化和茎坏死等症状。 3.2 黄瓜花叶病毒。 中文名：黄瓜花叶病毒 学名： Cucumber mosaic virus 缩写： CMV 分类地位：雀麦花叶病毒科（ Bromoviridae），黄瓜花叶病毒属（ Cucumovirus） 病毒粒子、传播途径及危害：病毒粒子为球状，直径 28 nm 30 n
4、m。主要由蚜虫以非持久性方式 传播。导致寄主出现花叶、黄化、皱缩等症状。 4 主要仪器设备、用具和试剂 4.1 仪器设备和用具 仪器设备和用具主要有： a) PCR 仪 ； b) 电泳仪； c) 水平电泳槽； DB 37/T 3893 2020 2 d) 凝胶成像仪； e) 高速冷冻台式离心机； f) 纯水仪； g) 万分之一天平； h) 普通冰箱（ 0 4）； i) -20低温冰箱； j) -70低温冰箱； k) 磁力搅拌器； l) 高压灭菌锅； m) 可调微量移液器（ 10 L、 100 L、 200 L、 1000 L、 5000 L）； n) RNase-free 吸头（ 10 L、
5、200 L、 1000 L）； o) RNase-free 离心管（ 1.5 mL、 2.0 mL）； p) RNase-free PCR 反应管。 4.2 试剂 所有实验用试剂均为分析纯；相关试剂配制方法详见附录 A；除特殊 说明外，均为符合 GB/T 6682， 实验用水为无菌超纯水或去离子水。 4.2.1 RNA 提取试剂 ： a) 多糖多酚植物 RNA 提取试剂盒或其他等效产品； b) 三氯甲烷； c) 异丙醇； d) 75%乙醇； e) RNase-free 超纯水。 4.2.2 反转录试剂： a) 随机引物； b) RNase 抑制剂； c) 逆转录酶： AMV 或其他等效酶； d
6、) dNTPs（ 10 mM）； e) -20C 贮藏。 4.2.3 PCR 试剂： a) DNA 聚合酶试剂盒： 2Es Taq MasterMix 或其他等效产品； b) DNA 分子量标记物： 100 bp 2000 bp； 50TAE 缓冲液； c) 核酸染料： Gelred（ 10000） 溶液或其他等效溶液； d) 含 10-4 倍浓度 Gelred 的 1%琼脂糖凝胶； e) 6DNA 上样缓冲液。 5 RT-PCR 检测方法 5.1 方法提要 DB 37/T 3893 2020 3 芋花叶病毒和黄瓜花叶病毒皆为 RNA病毒，利用 TransZol Plant多糖多酚植物 RNA
7、提取试剂盒进行 RNA纯化，然后进行 RT-PCR检测，通过琼脂糖凝胶电泳对检测结果进行判定。 5.2 样品采集 观察芋头叶片是否出现叶脉褪绿、脉间褪绿黄化、叶片皱缩、花叶、叶片畸形等典型病毒病症状， 取出现上述症状的样品装至无菌样品袋中，标记样品编号、取样时间、取样地点，于低温条件下（ 2 8）运送至实验室，放置 -70超低温冰箱保存备用。样品避免反复冻融。以通过分子检测不含病毒的 样品作为阴性对照，以确定感染 DsMV或 CMV的样品为阳性对照。以下操作对阴性对照、阳性对照进行 同样处理。 5.3 RNA 的提取和纯化 5.3.1 称 取 100 mg 样品 置 2 ml 离心 管 中，用
8、 液氮 速冻后迅速 研磨，然后加入 1 mL 裂解缓冲溶液（ 1 mL /100 mg 样品）， 剧烈振荡混匀，室温放置 5 min； 4， 13000 rpm 离心 5 min。 5.3.2 取上清液 于 1.5 mL 离心 管 中 ，加 等体积的缓冲液 2， 颠倒混匀后加入 1/4 体积三氯甲烷，再次 颠倒 混匀 ，室温 静 置 2 min 3 min。 4， 13000 rpm 离心 10 min。 5.3.3 将 上层水相 转入新的 1.5 mL 离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀， 室温 放置 10 min。 4， 13000 rpm 离心 10 min。 5.3.4 弃 上清液
9、 ， 加入 1 mL 预冷的 75 乙醇，洗涤沉淀。 4， 13000 rpm 离心 5 min。 5.3.5 重复 上述 步骤一次，彻底洗净 残留 盐 分 。 5.3.6 弃 上清液， 室温晾干 ， 加适量 RNase-free H2O 溶解。用紫外分光光度计测定 RNA 浓度 。 放置 -80 备用。 5.4 引物合成 依据文献报道引物序列进行合成（ DsMV： Reyes et al.， 2009； CMV：姚明华等， 2009）。引物配 制成 10 mol/L储存液备用。 表 1 RT-PCR 检测的引物序列 检测病毒 引物序列 扩增片段大小 /bp DsMV 正义引物： 5-AGGT
10、TGTATTGCAGGCAGATG-3 反义引物： 5-GCCAATAACTGTGGCCTGTT-3 1034 CMV 正义引物： 5-ATGGACAAATCTGAATCAACC-3 反义引物： 5-TAAGCTGGATGGACAACCCGT-3 777 5.5 检测 5.5.1 反转录合成 cDNA 第一链 取 纯化的 RNA合成 cDNA第一链，反应体系为 25 L，各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总 体积进行适当调整，反应体系成分见表 2。将上述试剂依次加入 RNase-free离心管 中 ，混匀后，放置于 42恒温水浴中 1 h后，转入 72恒温水浴 5 min， 用于 RT-PC
11、R扩增 或置 -20 以下冰箱备用。 DB 37/T 3893 2020 4 表 2 反应体系成分表 成分 用量 RNA 1.0 g dNTP（ 10 mM each） 5.0 L 随机引物 （ 10 mol/L） 2.0 L 5Reverse Transcriptase Buffer 5.0 L RNase 抑制剂 1.0 L AMV 逆转录酶（ 10 U） 1.0 L RNase-free H2O 补足 25.0 L 5.5.2 PCR 反应 5.5.2.1 反应体系 取合成的 cDNA第一链进行 RT-PCR反应。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总 体积进行适当调整。以水代
12、替模板作为空白对照。反应体系成分见表 3。 表 3 反应体系成分表 成分 用量 2Es Taq MasterMix 25.0 L 正义引物（ 10mol/L） 2.0 L 反义引物（ 10mol/L） 2.0 L cDNA 2.0 L RNase-free H2O 补足 50.0 L 5.5.2.2 反应程序 将上述反应成分混合好后，放置 PCR仪进行反应，反应程序参数见表 4。 表 4 反应程序参数 步骤 温度 时间 预变性 94 2 min 变性 94 30 s 35个循环 退火 56 30 s 延伸 72 1 min 终延伸 72 5 min 5.5.3 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳检测
13、 将 50TAE电泳缓冲液稀释成 1TAE电泳缓冲液，制备 1%的琼脂糖凝胶。取上述 PCR产 物 10 L， 加入上样缓冲液（终浓度为 1），混匀后移入胶孔，并在样品孔一侧加入 DNA分子量标记。电压大小 根据电泳槽长度确定，一般控制在 3 V/cm 5 V/cm，当溴酚蓝指示带移动到凝胶 2/3处时关闭电源。电 泳结束后，在凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩增出预期的特异性条带，拍摄并记录。 DB 37/T 3893 2020 5 6 结果判定及表述 6.1 结果判定 6.1.1 阴性对照和空白对照 未出现条带 ， 阳性对照出现预期大小的扩增条带（芋花叶病毒： 1034 bp； 黄瓜花叶病毒： 777 bp），待测样品未出现预期大小的扩增条带，则可判断样品为阴性。 6.1.2 阴性对照和空白对照 未出现条带 ， 阳性对照及 待测样品出现 与 所测病 毒 预期大小 的扩增条带 （芋 花叶病毒： 1034 bp；黄瓜花叶病毒： 777 bp） ， 则 判定 样品检测 结果为阳性。 6.1.3 阴性对照 或 空白对照 出现条带，阳性对照未出现预期大小扩增条带，出现以上情况之一，则不 予判定，重新鉴定。 6.2 结果表述 检出结果表述如下： a) 待测样品中检出芋花叶病毒或未检出芋花叶病毒； b) 待测样品中检出黄瓜花叶病毒或未检出黄瓜花叶病毒。 _
