1、ICS 67.050 X 04 DB37 山东省 地 方 标 准 DB 37/T 3816 2019 畜禽肌肉中肌苷酸含量测定 高效液相色谱法 Determination of inosine acid content in livestock and poultry muscle high performance liquid chromatography 2019 - 12 - 24 发布 2020 - 01 - 24 实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 3816 2019 I 前 言 本部分按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实
2、施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。 本标准主要起草人：呼红梅、朱荣生、王彦平 、赵雪艳、王怀中、王继英、王诚、蔺海朝、程立坤、 韩红、成建国、林松、郭建凤、刘畅、唐伟静、孙洁、胡顺营、莫贞峰、时冉冉。 DB37/T 3816 2019 1 畜禽肌肉中肌苷酸含量测定 高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了畜禽肌肉中肌苷酸含量测定。 本标准适用于畜禽肌肉中肌苷酸含量的测定。本方法检出限为 0.05 mg/g，定量限为 0.20 mg/g。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本
3、适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 9695.19 肉与肉制品 取样方法 3 原理 试样中的肌苷酸经 5 %高氯酸溶液（ 4.8）提取，再与 0.5 mol/L氢氧化钠溶液（ 4.9）发生反应生成 化学状态稳定的肌苷酸钠，采用高效液相色谱 (紫外检测器 )测定，外标法定量。 4 试剂或材料 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。 4.1 水： GB/T 6682，一级水。 4.2 甲酸铵。 4.3 高氯酸。 4.4 氢氧化钠。 4.5 肌苷酸标准品：纯度 98.0 %。 4.
4、6 甲醇：色谱纯。 4.7 甲酸铵缓冲溶液（ 50 mmol/L， pH 6.5）：准确称取 3.15 g甲酸铵（ 4.2）于烧杯，加 500 mL水 （ 4.1），用 0.5 mol/L氢氧化钠溶液（ 4.9）调至 pH 6.5，定容至 1 000 mL。用前 0.45 m滤膜过滤， 超声水浴脱气 20 min。 4.8 高氯酸溶液（ 5 %）：准确移取高氯酸（ 4.3） 5 mL，加 95 mL水（ 4.1）。 4.9 氢氧化钠溶液（ 0.5 mol/L）：将氢氧化钠（ 4.4）配成饱和溶液，密闭放置至溶液清亮，用塑料 管虹吸，准确移取 26 mL上清液于 1 000 mL水（ 4.1）中
5、。 4.10 肌苷酸标准储备液（ 1 mg/mL）：准确称取肌苷酸标准品（ 4.5） 15.31 mg (精确至 0.01 mg)， 水（ 4.1）定容至 10 mL。 4.11 肌苷酸标准系列工作溶液：准确移取 1 mg/mL肌苷酸标准储备液（ 4.10） 2、 4、 8、 10、 12、 14、 16 mL，水（ 4.1）定容至 100 mL，即为 0.02、 0.04、 0.08、 0.10、 0.12、 0.14、 0.16 mg/mL的肌苷酸 标准系列工作液。 DB37/T 3816 2019 2 4.12 微孔滤膜： 0.45 m无机系。 5 仪器和设备 5.1 高效液相色谱仪：配
6、备紫外检测仪。 5.2 离心机：转速不低于 4 000 rpm 。 5.3 高速组织匀浆机：转速不低于 8 000 rpm。 5.4 分析天平：感 量 0.1 mg和 0.01 mg各一台。 5.5 磁力搅拌器。 6 样品 按照 GBT 9695.19中取样方法，采集有代表性的样品 20 g左右，搅碎、均质，并转入塑料自封袋中， -20 保存备用。 7 测定步骤 7.1 提取 平行做 2份试验。 称取 1 g 2 g搅碎、均质的肌肉（精确至 0.000 1 g），置于 50 mL离心管中，准确加入 20 mL预冷 的 5 %高氯酸溶液（ 4.8），高速组织匀浆机 8 000 rpm匀浆 1 m
7、in后，转入 50 mL容量瓶， 5 %高氯酸（ 4.8） 定容。移取 20 mL 4 000 rpm离心 3 min，准确 移取上清液 10 mL，用 0.5 mol/L 氢氧化钠溶液（ 4.9）调 pH值至 6.5，转入 50 mL容量瓶用水（ 4.1）定容。用 0.45 m滤膜（ 4.12）过滤备用。 7.2 液相色谱参考条件 色谱柱：柱长 150 mm，粒径 5 m，内径 4.6 mm，或其他效果等同的 C18柱。 柱温： 30 。 紫外检测波长： 254 nm。 流动相：甲酸铵缓冲溶液（ 4.10） +甲醇 =95+5。 流速： 1.0 mL/min。 进样量： 10 L。 运行时间
8、： 10 min。 7.3 测定 7.3.1 上机测定 肌苷酸标准系列工作液（ 4.11）和提取溶液（ 7.1）上机测定。在上述色谱条件下，肌苷酸标准溶 液和样品肌苷酸提取液色谱图见附录 A。 7.3.2 定量 以肌苷酸的浓度为横坐标，肌苷酸标准系列工作液（ 4.11）的色谱峰面积（响应值）为纵坐标，绘 制标准曲线，其相关系数不低于 0.99。试样中待测物的响应值应在标准系列工作液测定的线性范围内（相 差不超过 30 %）。如果超出标准系统工作液测定范围，应将试样溶液取水进一步稀释后，重新测定。 DB37/T 3816 2019 3 7.4 实验数据处理 试样中肌苷酸含量 Ci，以质量分数表示
9、，单位为毫克 /克（ mg/g）。按式（ 1）计算。 sii= smC A VC A . (1) 式中： Ci 样品中肌苷酸的含量 (mg/g) ； Cs 标准工作液中肌苷酸的浓度 (mg/ml)； Ai 样品中肌苷酸所对应的峰面积响应值； As 标准工作液中肌苷酸所对应的峰面积响应值； V 样品提取液总体积 (ml)； M 样品质量 (g)。 测定结果用平行测定的算术平均值表示，结果保留 2位有效数字。 8 精密度 在重复条件下，获得两次独立测定值结果的绝对差值不大于这两个测定值的算数平均值的 10 %。 DB37/T 3816 2019 4 A A 附 录 A （资料性附录 ） 肌苷酸（ IMP）样品及标准品色谱图 肌苷酸（ IMP）标准品及样品色谱图见图 A.1、图 A.2。 图 A.1 肌苷酸（ IMP）标准品色谱图 图 A.2 某样品中肌苷酸（ IMP）色谱图 _
