1、ICS 11.220 B 41 DB37 山东省 地 方 标 准 DB 37/T 3821 2019 鸭新型呼肠孤病毒病诊断技术规范 Diagnostic techniques for novel duck reovirus disease 2019 - 12 - 24 发布 2020 - 01 - 24 实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 3821 2019 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院家禽研究所。 本标准主要起草人：于可响
2、、宋敏训、李玉峰、马秀丽、刘存霞、姜亦飞、胡峰、亓丽红、黄兵、 郭效珍、刘玉山。 DB37/T 3821 2019 1 鸭新型呼肠孤病毒病诊断技术规范 1 范围 本标准规定了鸭新型呼 肠孤病毒病的临床诊断、实验室诊断和综合判定技术规范。 本标准适用于鸭新型呼肠孤病毒病的诊断和流行病学调查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集
3、、保存与运输技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 鸭新型呼肠孤病毒病 又称“肉鸭脾坏死 症”、“番鸭出血性坏死性肝炎”，是由鸭新型呼肠孤病毒引起的多品种雏鸭脾 脏出血和坏死为主要特征的疾病。该病毒在血清学和基因序列上与原有的番鸭呼肠孤病毒有明显差异。 4 临床诊断 4.1 流行病学 该病一年四季均可发生，不同品种的鸭均可发病，如樱桃谷鸭、麻鸭、番鸭、半番鸭等；发病日龄 一般为 5 25日龄，其中以 5 10日龄居多，病程 5 7天。 4.2 临床症状 病鸭精神沉郁，发育不良，部分拉白色稀粪，一般不会出现神经症状，容易继发鸭疫里默氏杆菌、 大肠杆菌等细菌感染。发病率 5
4、 % 35 %，死亡率 20 %以下。 4.3 病理变化 脾脏表面出血 或坏死是其主要病变特征。 4.4 结果判定 DB37/T 3821 2019 2 符合 4.1流行病学特征，病鸭出现 4.2临床症状和 4.3病理变化，可判为鸭新型呼肠孤病毒病疑似病 例，应进行实验室确诊。 5 实验室诊断 除非另有规定，实验室诊断所用化学试剂均为分析纯；试验用水符合 GB/T 6682二级水的规定；实 验室生物安全要求按照 GB 19489执行。 5.1 病原分离鉴定 5.1.1 仪器和设备 5.1.1.1 高速冷冻离心机。 5.1.1.2 恒温培养箱。 5.1.2 试剂或材料 5.1.2.1 青链霉素（
5、青霉素 10 000 IU/mL，链霉素 10 000 g/mL）。 5.1.2.2 0.22 m 微孔滤器。 5.1.2.3 8 日龄 9 日龄鸭新型呼肠孤病毒抗体 阴性鸭胚。 5.1.3 病料处理 按 NY/T 541要求无菌采集发病鸭的脾脏 1 g 2 g，加入 10倍体积生理盐水和终浓度 2 000 IU/mL的 青链霉素，剪碎后充分研磨，反复冻融 2次 3次， 8 000 g离心 20 min，取上清液用 0.22 m微孔滤器 过滤，经菌检无菌后用于病原分离。 5.1.4 操作步骤 5.1.4.1 取 5.1.3 中处理好的上清液经尿囊腔接种 8 日龄 9 日龄鸭新型呼肠孤病毒抗体阴
6、性鸭胚， 0.1 mL/枚，共 5 枚。封口后置于 37 恒温箱继续孵化，每日照胚两次，记录鸭胚死亡情况，观察到 第 6 天。 5.1.4.2 弃掉接种后 24 h 内死亡的鸭胚， 若接种 6 天内鸭胚出现死亡，则收集死亡鸭胚的尿囊液，用 5.2、 5.3、 5.4 中的任意一种方法进行鉴定；若接种 6 天内鸭胚不出现死亡，则收集 6 天活胚的尿囊液， 用 5.2、 5.3、 5.4 中的任意一种方法进行鉴定。 5.1.5 结果判定 5.1.5.1 阳性：接种后死亡鸭胚或接种后 6 天活胚的尿囊液用 5.2、 5.3、 5.4 中的任意一种方法检测 为阳性。 5.1.5.2 阴性：接种后死亡鸭
7、胚或接种后 6 天活胚的尿囊液用 5.2、 5.3、 5.4 中的任意一种方法检测 为阴性。 5.2 RT-PCR 方法 5.2.1 仪器和设备 5.2.1.1 高速冷冻离心机。 5.2.1.2 PCR 扩增仪。 5.2.1.3 电泳仪。 DB37/T 3821 2019 3 5.2.1.4 紫外分析仪。 5.2.2 试剂或材料 5.2.2.1 TRIZol。 5.2.2.2 无 RNA 酶水。 5.2.2.3 反转录酶 M-MLV。 5.2.2.4 RNA 酶抑制剂。 5.2.2.5 Taq 酶。 5.2.2.6 琼脂糖。 5.2.2.7 Goldview DNA 染料。 5.2.2.8 阳
8、性参照物（鸭新型呼肠孤病毒）。 5.2.2.9 阴性参照物（阴性尿囊液）。 5.2.3 操作步骤 5.2.3.1 样品处理 按 NY/T 541要求无菌采集发病鸭的脾脏 1 g 2 g，加入 10倍体积生理盐水，用剪刀剪碎后，置于研 磨器中充分研磨，反复冻融 2次 3次， 8 000 g离心 10 min，取上清液 100 L用于 RNA提取。 5.2.3.2 RNA 提取 5.2.3.2.1 在 100 L 病料上清液中加入 1 mL TRIZol，剧烈颠倒 50 次 100 次，室温静 置 10 min 后， 加入 200 L 氯仿，上下颠倒 50 次 100 次，室温静置 5 min 1
9、0 min， 12 000 g 离心 10 min。 5.2.3.2.2 吸取上清加入等体积氯仿，上下颠倒 50 次 100 次， 12 000 g 离心 10 min。 5.2.3.2.3 吸取上清加入等体积的异丙醇，轻轻混匀后， -20 静置至少 30 min，然后 12 000 g 离 心 15 min 20 min。 5.2.3.2.4 弃上清液，加入 1 mL 75 %酒精， 12 000 g 离心 5 min 10 min。 5.2.3.2.5 弃上清液，倒置自然晾干，或 12 000 g 再离心 5 min，吸掉管底部的液体。 5.2.3.2.6 沉淀用 20 L 无 RNA 酶
10、水溶解，备用。阳性和阴性参照物 RNA 的提取同上。样品 RNA 提取 也可使用同等效果的商品化试剂盒。 5.2.3.3 引物 上游引物 P1： 5 TCATTCATTTGGGCAGCGG 3 下游引物 P2： 5 AGTAGTGTGTAAAGCATGGACT 3 5.2.3.4 RT-PCR 扩增 5.2.3.4.1 反转录（ RT）反应 反应体系为 10 L。在 PCR管中 加入 dNTP(10 mmol/L) 0.8 L，引物 P1(20 mol/L) 0.5 L，引物 P2(20 mol/L) 0.5 L， RNA 5.0 L， 放 PCR仪中 70 作用 5 min，然后取出冰浴 1
11、 min 2 min，再加入 RNA 酶抑制剂 (40 U/L) 0.5 L，反转录酶 M-MLV(200 U/L) 0.7 L， 5 M-MLV buffer 2 L，继续放 PCR 仪中 42 30 min， 95 2 min。 5.2.3.4.2 PCR 扩增 5.2.3.4.2.1 反应体系 DB37/T 3821 2019 4 反应体系为 50 L，配制见表 1。 表 1 PCR 反应体系配制 反应体系中各成分 每个样品反应组分用量 /L 10PCR buffer 4.5 20 mol/L 引物 P1 0.5 20 mol/L 引物 P2 0.5 RT 产物 5.0 5 U/L Ta
12、q E 0.5 ddH2O 39.0 总体积 50.0 5.2.3.4.2.2 反应程序 采用以下反应程序进行扩增： 第一阶段： 95 3 min； 第二阶段： 95 20 s， 55 20s， 72 30 s，共进行 30 个循环； 第三阶段： 72 10 min。 RT-PCR扩增也可使用商品化的 RT-PCR试剂盒，按说明书要求操作。 5.2.3.5 电泳 取 PCR扩增产物 6 L与 10上样缓冲液 1 L混合，加入到 1.5 %的琼脂糖凝胶孔中，同时在旁边点样 孔中加入 2 000 bp Ladder Marker（分子量标准物） 10 L，以 5 V/cm电压进行电泳 25 min
13、 30 min， 在紫外分析仪上观察结果 。 5.2.4 结果判定 5.2.4.1 试验成立条件 在阳性对照出现一条大小 226 bp的单一条带，同时阴性对照无此条带的情况下，检测结果成立。 5.2.4.2 结果判定 被检样品出现与阳性对照同样大小的条带时，判为阳性；被检样品未出现与阳性对照同样大小的条 带时，判为阴性。参见附录 A。 5.3 荧光 RT-PCR 方法 5.3.1 仪器与设备 5.3.1.1 高速冷冻离心机。 5.3.1.2 荧光定量 PCR 扩增仪。 5.3.2 试剂或材料 5.3.2.1 TRIZol。 5.3.2.2 无 RNA 酶水。 5.3.2.3 SYBR Gree
14、n 荧光 RT-PCR 反应液（ 2 SYBR Premix）。 DB37/T 3821 2019 5 5.3.2.4 阳性参照物（鸭新型呼肠孤病毒）。 5.3.2.5 阴性参照物（阴性尿囊液）。 5.3.3 操作步骤 5.3.3.1 样品处理 参见 5.2.3.1。 5.3.3.2 RNA 提取 参见 5.2.3.2。 5.3.3.3 引物 上游引物 P3： 5 ATCGCACTATTGACGCACTT 3 下游引物 P4： 5 TTGACGACGCCAATCCC 3 5.3.3.4 荧光 RT-PCR 扩增 5.3.3.4.1 反转录（ RT）反应 参见 5.2.3.4.1。 5.3.3.
15、4.2 荧光 PCR 5.3.3.4.2.1 反应体系 反应体系为 25.0 L，配制见表 2。 表 2 荧光 PCR 反应体系配制 反应体系 中各成分 每个样品反应组分用量 /L 2SYBR Premix 12.5 20 mol/L 引物 P3 0.5 20 mol/L 引物 P4 0.5 RT 产物 1.0 ddH2O 10.5 总体积 25.0 5.3.3.4.2.2 反应程序 采用以下反应程序进行扩增： 第一阶段： 95 45 s； 第二阶段： 95 10 s， 56 10 s， 72 15 s， 40 个循环，每次循环在 72 延伸时收集 荧光。 荧光 RT-PCR扩增也可使用商品化
16、的 Real-time RT-PCR试剂盒，按说明书操作。 反应结束后根 据分析软件得出的 Ct值和扩增曲线来判定结果。 5.3.4 结果判定 5.3.4.1 试验成立条件 DB37/T 3821 2019 6 在阳性对照的 Ct值 33且出现典型扩增曲线，阴性对照 Ct值 35的情况下，试验成立。 5.3.4.2 结果判定 当被检样品 Ct值 33且出现典型扩增曲线时，判为阳性；当被检样品无 Ct值或者 Ct值 35时，判为 阴性；当被检样品 Ct值在 33-35之间时判为可疑，需重做，再次检测结果的 Ct值 35，且出现典型扩增 曲线，则判为阳性，否则判为阴性。参见附录 B。 5.4 RT
17、-LAMP 方法 5.4.1 仪器与设备 5.4.1.1 高速冷冻离心机。 5.4.1.2 水浴锅。 5.4.1.3 紫外分析仪。 5.4.2 试剂或材料 5.4.2.1 TRIZol。 5.4.2.2 无 RNA 酶水。 5.4.2.3 甜菜碱（ betaine）。 5.4.2.4 TritonX-100。 5.4.2.5 反转录酶 AMV。 5.4.2.6 RNA 酶抑制剂。 5.4.2.7 Bst DNA 聚合酶。 5.4.2.8 SYBR Green染料。 5.4.2.9 阳性参照物（鸭新型呼肠孤病毒）。 5.4.2.10 阴性参照物（阴性尿囊液）。 5.4.3 操作步骤 5.4.3.
18、1 样品处理 参见 5.2.3.1。 5.4.3.2 RNA 提取 参见 5.2.3.2。 5.4.3.3 引物 RT-LAMP检测引物序列见表 3。 表 3 RT-LAMP 引物序列 引物名称 序列（ 5 -3 ） NDR-F3 TGAGATATATTAGGGTGGGTC NDR-B3 GACATGCCTAGTATGGAGCAT NDR-FIP agcgatatcctgaggttgctTTTGCCATTGCTCTGCATGTC NDR-BIP aggcgaggatatgacgc TTTTCATCGATCATCTTCCAACCC DB37/T 3821 2019 7 5.4.3.4 RT-LA
19、MP 扩增 5.4.3.4.1 反应体系 反应体系为 25.0 L，配制见表 4。 表 4 RT-LAMP 反应体系配制 PCR 反应体系中各成分 每个样品反应组分用量 /L 10Bst buffer 2.5 10 mmol/L dNTP 1.0 25 mmol/L MgCl2 3.0 5 mol/L Betaine 2.0 10 mol/L 外引物 NDR-F3 0.5 10 mol/L 外引物 NDR-B3 0.5 40 mol/L 内引物 NDR-FIP 1.0 40 mol/L 内引物 NDR-BIP 1.0 40 U/L RNA 酶抑制剂 1.0 5 U/L 反转录酶 AMV 1.0
20、 8 U/L Bst DNA 聚合酶 1.0 RNA 5.0 无 RNA 酶水 5.5 总体积 25.0 5.4.3.4.2 反应程序 采用以下反应程序进行扩增： 第一阶段： 63 45 min； 第二阶段： 85 2 min。 5.4.4 结果判定 5.4.4.1 试验成立条件 反应结束后，取 1 L 10倍稀释的 SYBR Green加入产物中，混匀后在紫外线下观察。在阳性对照 出现黄绿色荧光，同时阴性对照不出现黄绿色荧光的情况下，试验成立。 5.4.4.2 结果判定 在紫外线下被检样品出现黄绿色荧光，判为阳性；在紫外线下被检样品未出现黄绿色荧光，判为阴 性。参见附录 C。 6 综合判定
21、符合临床诊断规定的疑似病例经 5.2、 5.3、 5.4中的任一方法检测，结果为阳性者，可判定为鸭新 型呼肠孤病毒病。 DB37/T 3821 2019 8 A A 附 录 A （资料性附录） RT-PCR 结果电泳图 RT-PCR结果电泳图见图 A.1。 说明： M DNA Marker DL2000； 1 阳性对照； 2 临床样品 1； 3 临床样品 2； 4 阴性对照。 图 A.1 RT-PCR 结果电泳图 DB37/T 3821 2019 9 B B 附 录 B （资料性附录） 典型扩增曲线示意图 典型扩增曲线示意图见图 B.1。 说明： 1 阳性对照； 2 临床样品 1； 3 临床样品 2； 4 阴性对照。 图 B.1 典型扩增曲线示意图 DB37/T 3821 2019 10 C C 附 录 C （资料性附录） RT-LAMP 结果示意图 RT-LAMP结果示意图见图 C.1。 说明： 1 阳性对照； 2 临 床样品 1； 3 临床样品 2； 4 阴性对照。 图 C.1 RT-LAMP 结果示意图 _
