1、ICS 13.060 Z 16 DB37 山东省 地 方 标 准 DB37/T 3787 2019 水质 粪大肠菌群测定 光度法 Water quality determination of fecal coliforms photometric method 2019 - 12 - 24 发布 2020 - 01 - 24 实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 3787 2019 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 分光光度法 . 1 5 荧光法 . 4 DB37/T 3787 2019 II 前 言 本标准按照 G
2、B/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由山东省生态环境厅提出并组织实施。 本标准由山东省环保标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省生态环境监测中心、青岛佳明测控科技股份有限公司、北京华夏科创仪器 股份有限公司。 本标准主要起草人：李恒庆、由希华、宗雪梅、王婷、王聪、郑琳琳、邹康、潘光、周成、张芳、 张爱芳。 DB37/T 3787 2019 1 水质 粪大肠菌群测定 光度法 1 范围 本标准规定了测定水中粪大肠菌群的分光光度法和荧光法。 本标准适用于地表水、生活污水和工业废水中粪大肠菌群的应急现场快速测定。 本方法的检出限为 30 MPN/L，检测范围： 30 109 MPN
3、/L，检测周期 不大于 18 h。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 14581 水质 湖泊和水库采样技术指导 HJ/T 91 地表水 和污水监测技术规范 HJ 494 水质 采样技术指导 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 粪大肠菌群 fecal coliforms 44.5 培养能发酵乳糖产酸产气的需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。 3.2 最大可能数 most probable number， MPN 最大可能数
4、（ most probable number，缩写为 MPN），又称稀释培养计数，是一种基于泊松分布的 间接计数法。利用统计学原理，根据一定体积不同稀释度样品经培养后产生的目标微生物阳性数，查表 估算一定体积样品中目标微生物存在的 数量（单位体积存在目标微生物的最大可能数）。 4 分光光度法 4.1 方法原理 一定量的水样与选择性培养基混合均匀放置于 44.5 环境下，粪大肠菌群产生 -半乳糖苷酶（ -D-galactosidase），并分解色原底物释放出色原体使培养基呈现颜色变化，通过连续分光光度（波长： 300 nm 600 nm）测定，依据待测水样色度变化与水中粪大肠菌群数成一定关系的原
5、理，得出粪大肠菌 群浓度。 4.2 干扰和消除 DB37/T 3787 2019 2 4.2.1 活性氯具有氧化性，能破坏微生物细胞内的酶活性，导致细胞死亡，可在样品采集（ 4.5.1）时 加入硫代硫酸钠溶液（ 4.3.4） 消除干扰。 4.2.2 重金属离子具有细胞毒性，能破坏微生物细胞内的酶活性，导致细胞死亡，可在样品采集（ 4.5.1） 时加入乙二胺四乙酸二钠溶液（ 4.3.5）消除干扰。 4.3 试剂和材料 除非另有说明 ，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂。 4.3.1 粪大肠菌群检测试剂主要成分： 蛋白胨： 5 g； 硫酸锰： 0.005 g； 硫酸镁： 0.001 g； 硫酸锌
6、： 0.001 g； 磷酸盐： 1.78 g； 两性霉素 B： 0.60 g； 蒸馏水 1 000 mL。 制法：上述试剂溶于蒸馏水中，充分混匀，调整 pH值为 7.2 7.4， 68.95 kPa(115 )，高压灭菌 20 min，分装贮存于 4 避光备用。 注： 也可采用市售商品化培养基制品。 4.3.2 硫代硫酸钠（ Na2S2O35H2O）。 4.3.3 乙二胺四乙酸二钠（ C10H14N2O8Na22H2O）。 4.3.4 硫代硫酸钠溶液：（ Na2S2O3） =0.10 g/mL，称取 15.7 g硫代硫酸钠（ 4.3.2），溶于适量水 中，定容至 100 mL，临用现配。 4.
7、3.5 乙二胺四乙酸二钠（ EDTA-Na2）溶液：（ C10H14N2O8Na22H2O） =0.15 g/mL，称取 15 g乙二胺四 乙酸二钠（ 4.3.3），溶于适量水中，定容 至 100 mL，此溶液保质期为 30 d。 4.3.6 无菌水：取适量纯水，经 121 高压蒸汽灭菌 20 min，备用。 4.4 仪器和设备 4.4.1 采样瓶：具螺旋帽或磨口塞的 100 mL、 250 mL、 500 mL广口玻璃瓶。 注： 在采集不存在或不考虑余氧、金属离子干扰的样品时，可采用市售无菌采样瓶或无菌采样袋。 4.4.2 微生物快速检测仪： 恒温培养单元：不少于 2 个温控系统，温度控制精
8、度 1 ，可自动调节待检测样本培养温度 （ 44.5 1 ）； 检测单元：不少于 4个独立的检测系统，可实现多个样本的同时监测； 数据显示、处理单元：自动输出检测结 果，可查询和显示历史数据。 4.4.3 高压蒸汽灭菌器： 121 可调、 101.3 kpa。 4.4.4 量筒： 50 mL、 100 mL。 4.4.5 移液管： 1 mL、 10 mL。 4.4.6 天平：感量 0.01 g。 注： 移液管、采样瓶等玻璃器皿及采样器具试验前应按无菌操作要求包扎， 121 高压蒸汽灭菌 20 min，烘干，备 用。 4.5 样品 4.5.1 样品采集 DB37/T 3787 2019 3 点位
9、布设及采样频次按照 GB/T 14581、 HJ 494和 HJ/T 91的相关规定执行。 与其它项目一同采样时，先单独采集微生物样品，采样瓶（ 4.4.1）不得用水样洗涤，采集水样于 灭菌的采样瓶中。 采集河流、湖 库等地表水样时，可握住瓶子下部直接将带塞采样瓶插入水中，约距水面 10 cm 15 cm 处，瓶口朝水流方向，拔玻璃塞，使水样灌入瓶内然后盖上瓶塞，将采样瓶从水中取出。如果没有水流， 可握住瓶子水平往前推。采样量一般为采样瓶容量的 80%左右。采好水样后，迅速扎上无菌包装纸。 采集地表水、废水样品及一定深度的水样时，可使用灭菌过后专用采样装置采样。 在同一采样点进行分层采样时，应
10、自上而下进行，避免不同层次的搅扰。 如果采集的是含有活性氯的样品时，需在采样瓶灭菌前加入硫代硫酸钠溶液（ 4.3.4），以除去活 性氯对细菌的 抑制作用 (每 125 mL容积加入 0.1 mL的硫代硫酸钠溶液 )；如果采集的是重金属离子含量较 高的样品，则在采样瓶灭菌前加入乙二胺四乙酸二钠（ EDTA-Na2）溶液（ 4.3.5），以消除干扰（每 125 mL容积加入 0.3 mL的乙二胺四乙酸二钠溶液）。 注： 15.7 mg硫代硫酸钠 (4.3.2)可去除样品中 1.5 mg活性氯，硫代硫酸钠用量可根据样品实际活性氯量调整。 4.5.2 样品保存 采样后应在 2 h内检测，否则，应 10
11、 以下冷藏但不得超过 6 h。实验室接样后，不能立即开展检 测的，将样品于 4 以下冷藏并在 2 h内检 测。 4.6 分析步聚 4.6.1 接种 接种待测水样于装有 5 mL培养基的检测瓶中，定容至 20 mL，水样与培养基应充分混匀。 4.6.2 培养 打开仪器电源开关，待仪器 稳定 30 min后，将接种后的检测瓶放置于微生物快速检测仪中，按照仪 器说明书进行操作，设置检测温度为 44.5 ，点击“检测”按 钮， 2 18小时，仪器自动培养得出结果。 4.6.3 对照试验 4.6.3.1 空白对照 采用无菌水（ 4.3.6）作为待测水样按照本标准 4.6.1 4.6.2进行空白测定，测试
12、结果不得检出， 否则该次样品测定结果无效，应重新测定空 白以及待测样品。 4.6.3.2 阴性及阳性对照 粪大肠菌群 的阴性、阳性菌株参考表 1。 表 1 阴性、阳性菌株参照表 检测指标 阳性菌种 阴性菌种 粪大肠菌群 大肠埃希氏 菌（耐热型） 、克雷伯氏菌 属(Klebsiella trevisan)（耐热型） 产气肠杆菌、粪链球菌 (Streptococcus faecalis)、假单胞菌属 将标准菌株制成 300 3 000个 /mL的菌悬液，将菌悬液按接种（ 4.6.1）和培养（ 4.6.2）要求操作， 阳性菌株应呈现阳性反应；阴性菌株呈现阴性反应，否则，该次样品测定结果无效，应重新测
13、定。 注： 可先制备较高浓度菌悬液， 采用血球计数器在显微镜 下对其浓度进行初步测定，再根据实际情况用无菌水 (4.3.6)稀释至 300 MPN/mL 3 000 MPN/mL。 DB37/T 3787 2019 4 4.7 结果计算与表示 微生物快速检测仪自动计算检测结果，结果以科学计数方法表示。 4.8 精密度和准确度 微生物检测数据为偏态分布，按其统计分析要求，其检测所得结果全部经对数（以 10为底）转换后 进行以下分析。 4.8.1 精密度 6家实验室对粪大肠菌群有证标准样品（ 7 620 MPN/L）进行测定： 实验室内相对标准偏差为 1.92 % 4.77 %，实验室间相对标准偏
14、差为 3.98 %，重复性限为 0.32，再 现性限为 0.52。 6家实验室对 3个不同浓度实际样品（浓度为 107 MPN/L、 105 MPN/L、 103 MPN/L）进行测定： 实验室内的相对标准偏差范围分别为： 0.64 % 2.36 %、 1.07 % 3.06 %、 2.42 % 6.81 %，实验 室间的相对标准偏差分别为： 0.91 %、 0.89 %、 2.64 %，重复性限为 0.34、 0.35、 0.49，再现性限为 0.36、 0.35、 0.52。 4.8.2 准确度 6家实验室分别对有证标准菌株（所使用的标准菌株浓度为 7 620 MPN/L）进行测定，相对误
15、差为： -8.24 % 1.43 %，相对误差的最终值为： -3.56 % 7.82 %。 4.9 质量保证和质量控制 4.9.1 每批样品按对照试验（ 4.6.3）进行空白对照测定，定期使用有证标准菌株进行阳性、阴性对照 试验。 4.9.2 每批次实验取待测水样数量的 10 %，做双样分析，检测结果以双样平均值计。 4.9.3 对每批次培养基应使用有证标准菌株进行培养基质量检验。 4.9.4 按有证标准菌株保存条件的要求，严格控制质量。 4.10 废弃物的处理 实验产生的废弃物经 121 高压蒸汽灭菌 20 min后，作为一般废物处理。 5 荧光法 5.1 方法原理 一定量的水样与选择性培养
16、基混合均匀放置于 44.5 环境下，粪大肠菌群产生 -半乳糖苷酶（ -D-galactosidase），并分解 -半乳糖苷释放出荧光。疏水的荧光产物聚合至光学检测区，通过光度 计（波长： 350 nm 650 nm）测定，依据荧光强度与水中粪大肠菌群数成一定关系的原理，从而得出粪 大肠菌群浓度。 5.2 干扰和消除 按本标准 4.2条进行。 5.3 试剂和材料 DB37/T 3787 2019 5 除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂。 5.3.1 粪大肠菌群检测试剂主要成分： 聚合氨基酸 1.3 g； 氯化钠 0.34 g； 磷酸盐 0.36 g。 制法：聚合氨基酸、氯化钠和磷
17、酸盐， 3种固体 粉末至于容器中充 分混匀， 115 高压灭菌 20 min， 贮存于 4 避光备用。 注： 也可采用市售商品化培养基制品。 5.3.2 硫代硫酸钠（ Na2S2O35H2O）。 5.3.3 乙二胺四乙酸二钠（ C10H14N2O8Na22H2O）。 5.3.4 硫代硫酸钠溶液：同 4.3.4。 5.3.5 乙二胺四乙酸二钠（ EDTA-Na2）溶液：同 4.3.5。 5.3.6 无菌水：同 4.3.6。 5.4 仪器和设备 按本标准 4.4条进行。 5.5 样品 5.5.1 样品采集 按本标准 4.5.1进行。 5.5.2 样品保存 按本标准 4.5.2进行。 5.6 分析步
18、聚 5.6.1 接种 接种待测水样于装有 2 g培养基的检测瓶中，定容至 100 mL，水样与培养基应充分混匀。 5.6.2 培养 打开仪器电源开关，待仪器 稳定 30 min后，将接种后的检测瓶放置于微生物快速检测仪中，按照仪 器说明书进行操作，设置检测温度为 44.5 ，点击“检测”按钮， 2 18小时，仪器自动培养得出结果。 5.6.3 对照试验 5.6.3.1 空白对照 采用无菌水（ 5.3.6）作为待测水样按照步骤 5.6.1 5.6.2进行空白测定，测试结果不得检出，否 则该次样品测定结果无效，应重新测定空白以及待测样品。 5.6.3.2 阴性及阳性对照 按本标准 4.6.3.2进
19、行。 5.7 结果计算与表示 DB37/T 3787 2019 6 微生物快速检测仪自动计算检测结果，结果以科 学计数方法表示，保留三位有效数字。 5.8 精密度和准确度 微生物检测数据为偏态分布，按其统计分析要求，其检测所得结果全部经对数（以 10为底）转换后 进行以下分析。 5.8.1 精密度 6家 实验室对粪大肠菌群有证标准样品（ 6 530 MPN/L）进行测定： 实验室内相对标准偏差为 2.32 % 4.15 %，实验室间相对标准偏差为 1.84 %，重复性限为 0.36，再 现性限为 0.38。 6家实验室对 3个不同浓度实际样品（浓度为 107 MPN/L、 105 MPN/L、
20、 103 MPN/L）进行测定： 实验室内的相对标准偏差范围分别为： 1.30 % 3.93 %、 1.94 % 4.72 %、 1.88 % 4.54 %，实验 室间的相对标准偏差分别为： 1.14 %、 1.59 %、 1.72 %，重复性限为 0.55、 0.51、 0.35，再现性限为 0.56、 0.53、 0.36。 5.8.2 准确度 6家实验室分别对有证标准菌株（所使用的标准菌株浓度为 6 530 MPN/L）进行测定，相对误差为： -2.75 % 1.71 %，相对误差的最终值为： -0.48 % 3.68 % 。 5.9 质量保证和质量控制 5.9.1 每批样品按对照试验（ 5.6.3）进行空白对照测定，定期使用有证标准 菌株进行阳性、阴性对照 试验。 5.9.2 每批次实验取待测水样数量的 10 %，做双样分析，检测结果以双样平均值计。 5.9.3 对每批次培养基应使用有证标准菌株进行培养基质量检验。 5.9.4 按有证标准菌株保存条件的要求，严格控制质量。 5.10 废弃物的处理 按本标准 4.10进行。 _
