1、ICS 65.020 B 16 DB37 山东省 地方标准 DB 37/T 3771 2019 枣疯病综合防控技术规程 Technical regulation for integrated management of jujube witches-broom 2019 - 12 - 05 发布 2020 - 01 - 05 实施 山东省市场监督管理局 发布 DB 37/T 3771 2019 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由山东省农业农村厅提出并 组织实施。 本标准由山东农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省果树研究所、山东省农业科学院
2、植物保护研究所。 本标准主要起草人：高瑞、王洁、周广芳、路兴波、杨淑珂、孙红炜、艾呈祥、张琼、王中堂、余 贤美。 DB 37/T 3771 2019 1 枣疯病综合防控技术规程 1 范围 本标准规定了枣疯病发病规律、发病症状、普查、鉴定及综合防治措施。 本标准适用于山东省枣产区枣疯病综合防治。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 8321（所有部分） 农药合理使用准则 NY/T 393 绿色食品 农药使用准则 NY/T 1276 农药安全使用
3、规范总则 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 植原体 Phytoplasma 一类无细胞壁、不能人工培养的单细胞原核生物、专性寄生于寄主植物韧皮部筛管组织和传播介体 昆虫的肠道、淋巴、唾腺等组织，对四环素类 抗生素敏感。侵染植物后常引起叶片黄化、丛枝、矮化、 茎杆带化及花器绿变等症状。 3.2 枣疯病 Jujube witches -broom 由枣疯病植原体（ Jujube witches -broom phytoplasma）侵染引起的一种枣树致死性、维管束系 统性病害。 3.3 枣疯病双抗夹心酶联免疫吸附（ DAS-ELISA）检测 利用枣疯病植原体免疫膜蛋白抗体（来源
4、于兔）及碱性磷酸酯酶标记的羊抗兔进行 ELISA检测样品 的吸光值（ I）与健康植株（ H）的吸光值。根据 I/H的比值来判断枣疯植原体的存在与否。 4 发病规律 4.1 传播途 径 枣疯病植原体主要通过媒介昆虫、嫁接和带病苗木进行传播。 DB 37/T 3771 2019 2 4.2 发病特点 枣疯病潜伏期及危害情况与品种、生态环境和管理条件等因子有关。在冷凉地区发病较轻，管理粗 放的枣树发病较重。品种间枣疯病发生情况差异很大，一般从局部枝条先发病，逐渐蔓延，一般感病枣 树发病后，小树 1年 2年，大树 5年 6年全树即死亡。 5 发病症状 5.1 根部症状 初期表皮呈褐色，萌生的根蘖呈丛枝
5、状，后期形成点发性溃疡斑，继而枯死。 5.2 枝条症状 病株枝条的主芽、隐芽和副芽多次萌发，形成节间缩短的细弱丛生状枝条，伴随叶片变小黄化，休 眠期不脱落。 5.3 花器症状 花器退化返祖，花梗延长至正常花梗的 3倍 6倍，有些病株萼片、花瓣、雄蕊发育成小叶，呈花变 叶状；有些病株萼片、花瓣变为绿色，雄蕊和雌蕊败育，呈绿瓣状。 5.4 果实症状 结果少或不结果，果实小、花脸，肉质硬，口感差。 6 普查与鉴定 6.1 田间普查 每年 8月 10月进行逐株检查，枝条节间缩短、簇生，叶片黄化变小为病害诊断主要依据，对查出 的病株做好明显标记，统计发病率。 6.2 室内病原鉴定 6.2.1 聚合酶链式
6、反应（ PCR）检测方法 检测方法见附录 A。 6.2.2 双抗夹心酶联免疫吸附（ DAS-ELISA）检测方法 检测方法见附录 B。 7 防治措施 7.1 检疫措施 加强枣树接穗、砧木等繁殖材料和苗木的检疫和检测，不使用来自枣疯病发生区的枣苗建园。发现 带病或带菌植物繁殖材料应及时销毁，防止病害扩散蔓延。 7.2 建园要求 DB 37/T 3771 2019 3 7.2.1 园地选择 新建枣园宜在没有发生枣疯病的地块建园。 7.2.2 立地条件 平原、丘陵、山地均可栽培，选择地势较高，土质疏松，耕作层深厚，排水良好的沙壤土或壤土种 植。盐碱土壤地区，应选 5 cm 60 cm土层，总盐量低于
7、 0.3 %的地块。 7.2.3 品种及苗木选择 建园时优先选用耐病品种的苗木、砧木或接穗。推广应用脱毒苗，在网室内建立优良品种无毒采穗 圃。 7.3 栽培管理措施 7.3.1 肥水管理 因地制宜，秋季施基肥，适时追肥，合理施用叶面肥。土壤水分保持在田间土壤相对含水量 60 % 70 %为最佳，根据土壤墒情、不同生长时期适时灌水，并应设置排水沟，雨季及时排水防涝。 7.3.2 合理修剪 适度修剪，合理整形，提高树体通透性和光照强度。 7.4 病株的处理与更新 7.4.1 销毁补栽 新建园应首先对传病媒介等进行一次防治，然后将病株连根挖除并销毁，经土壤消毒、充分晾晒树 坑后再进行补栽。 7.4.
8、2 输液治疗 在进行疯枝清理后，可辅助树干输液（滴注）延缓病情发展，最佳治疗时期为枣树展叶期。输液治 疗方法见附录 C。 7.5 防治媒介昆虫 主要传毒媒介为中 华拟菱纹叶蝉（ Hishimonoides chinensis A.）、凹缘菱纹 叶蝉（ Hishimonus selltus U.）、片突菱纹叶蝉（ Hishimonus lamellatus C.）和红闪小叶蝉（ Typhlocyba sp.）等。可 选用内吸性、触杀性的杀虫剂，使用方法按照 GB/T 8321、 NY/T 393和 NY/T 1276执行 。 DB 37/T 3771 2019 4 A A 附 录 A （规范性附
9、录） 枣疯病病原聚合酶链式反应（ PCR）检测方法 A.1 感病和健康枣树总 DNA提取方法 采取症状明显的和健康的枣树幼嫩枝条、叶片或者花样本，样本 短时间（ 1周内）可于 4 冰箱保 存，长时间需于 -80 冰箱保存。用商品化植物基因组 DNA快速提取试剂盒提取。 A.2 PCR扩增引物、反应体系及程序 A.2.1.1 以植原体 16S rRNA基因通用引物 R16mF2（ 5-CAT GCA AGT CGA ACG GA-3） /R16mR1（ 5-CT T AAC CCC AAT CAT CGA C-3）进行 PCR扩增。并设置健康枣树组织 DNA为阴性对照，清水为空白对照。 A.2.
10、1.2 PCR 反应体系： PCR反应体系参照 Taq 酶说明书。扩增程序： 预变性温度 94 ， 3 min；然 后 94变性 45 s， 60 退火 1 min， 72 延伸 2 min， 35个循环。最后 72 延伸 10 min。 A.3 电泳检测 PCR产物于 1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测。阳性材料直接 PCR扩增片段大小约 1.4 kb，阴性对照及空白 对照均应无扩增片段。 A.4 序列测定及分析 PCR产物直接送测序公司测序。将所得 DNA序列输入 GenBank（ http:/www.ncbi.nlm.nih.gov）进行 Blast检索，初步确定病原种类。 DB 37/T 3
11、771 2019 5 B B 附 录 B （规范性附录） 枣疯病植原体双抗夹心酶联免疫吸附（ DAS-ELISA）检测方法 B.1 样品处理 将疑似病样按照 1:10或 1:100的比例加入抗原包被缓冲液，研磨后取上清备用。 B.2 样品包被 取 150 L稀释的检测样品液加入 96孔酶标板中，以枣疯植原体阳性标准品为阳性对照，以健康枣 树标准品为阴性对照，在 4 条件下孵育过夜或 37 孵育 1 h 2 h。 B.3 洗板 将酶联板迅速反扣，弃去孔中液体，每孔加入 PBST液 200 L，静置 3 min 5 min后迅速弃去孔中 液体，并在吸水纸上扣打几下以尽量除去孔中液体，重复 3次。
12、B.4 封闭 去除酶标 板中的 PBST缓冲液，每孔加入 150 L的封闭缓冲液， 37 恒温箱孵育 1.5 h。 B.5 洗板 同步骤 C.3。 B.6 加一抗 用 PBST稀释枣疯植原体免疫膜蛋白抗体（来源于兔）至合适的工作浓度（ 1:1 000），每孔样品加 150 L， 37 恒温箱孵育 2 h。 B.7 洗板 同步骤 C.3。 B.8 加酶标抗体 每孔加入 150 L PBST稀释的碱性磷酸酯酶标记的羊抗兔（ 1:5 000）， 37 恒温箱孵育 2 h。 B.9 洗板 DB 37/T 3771 2019 6 同步骤 C.3。 B.10 底物显色 每孔加底物溶液 150 L；室温避光
13、显色 30 min 60 min； 酶联仪在 405 nm下读数。 B.11 结果判定 I/H=（待测样品读数空白读数） /（阴性样品的读数空白读数） 3判断为阳性反应；反之则为 阴性。 DB 37/T 3771 2019 7 C C 附 录 C （规范性附录） 药剂防治枣疯病的方法 药剂防治枣疯病的方法见表 C.1。 表 C.1 药剂防治枣疯病的方法 药剂选择 四环素类农用抗生素 使用时间 枣树展叶期， 5 月上旬 使用 方法 配药 药液需随用随配。按照药剂使用说明，用适量的干净清水溶解药后，用 4 层 6 层纱布或滤纸过滤，减少沉淀。每瓶装药液 500 mL。 打孔 对应疯枝方向在主干距地
14、面 20 cm 处，向下倾斜 45 钻深达木质部 2 cm 3 cm，孔径 0.45 cm 的注药孔。若多侧均有疯枝时，打孔数量依据树干直径决定，树干直径 10 cm，只需打对应最 严重的疯枝方向打 1 个孔，树干直径 10 cm，打 2 个孔，树干直径每增加 10 cm，就多增加 1 个孔， 1 棵树最多打 4 个孔。孔与孔之间沿树干水平均匀分布，垂直有 10 cm 落差。注意注药孔 附近不能有树洞和裂缝，避免造成漏液。 输液 输液瓶悬挂在距地面至少 1.5 m 的位置。清理干净孔中的碎木屑避免堵塞针头。不漏液且能正常滴液后，放到最大输液速度处输液。输完液后用泥巴涂抹好孔口 ，以防药液挥发。 使用药量 树干直径 10 cm 15 cm，一次使用 2 瓶； 15 cm 20 cm，一次使用 4 瓶； 20 cm 25 cm，一次使用 6 瓶， 25 cm 30 cm 使用 8 瓶。 30 cm 以上每增加 1 cm多使用 0.5 瓶药液。 使用次数 一般 1 月 1 次，连续输液 2 3个月，可延缓病害发生。 _
