1、ICS 65.020.20 B 05 DB37 山东省 地 方 标 准 DB 37/T 3690.2 2019 液体菌种制备技术规程 第 2 部分：黑木耳 Technical specifications for the preparation of liquid spawn part2： Auricularia heimuer 2019 - 09 - 20 发布 2019 - 10 - 20 实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 3690.2 2019 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 基本要求 . 3 4.1 人
2、员要求 . 3 4.2 产地环境要求 . 3 4.3 生产设备与设施 . 3 5 生产技术 . 3 5.1 工艺流程 . 3 5.2 品种选择 . 4 5.3 母种活化 . 4 5.4 摇瓶液体菌种生产 . 4 5.5 发酵罐液体菌种生产 . 5 6 贮存 . 7 7 生产档案 . 7 附 录 A （规范性附录） 黑木耳液体菌种生产记录事项 . 8 DB37/T 3690.2 2019 II 前 言 本标准依据 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由山东省农业农村厅提出并 组织 实施。 本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业技术推广总站、泰安市农业科
3、学研究院、山东博华高效生态农业科技 有限公司、山东福禾菌业科技股份有限公司。 本标准 主要起草人：高霞、高中强、高瑞杰、司元明、王庆武、赵淑芳、张燕、崔慧、李晓博、于 安军、魏德军、门庆永、兰玉菲、丛倩倩、彭玮航、李树林、李东起、杨鹏、高杰、赵建俊。 DB37/T 3690.2 2019 1 液体菌种制备技术规程 第 2 部分：黑木耳 1 范围 本标准规定了黑木耳液体菌种术语和定义、基本要求、生产技术和生产档案管理等要求。 本标准适用于黑木耳液体菌种的制备。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，
4、其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 150 压力容器 GB 5749 生活饮用水卫生标准 GB/T 12728 食用菌术语 GB 19169 黑木耳菌种 GB 50073 洁净厂房设计规范 NY/T 528 食用菌菌种生产技术规程 3 术语和定义 GB/T 12728界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 食用菌液体菌种发酵罐 edible mushroom liquid strain fermenter 进行食用菌液体菌种培养的专用发酵设备，应符合 GB 150要求。 3.2 食用菌液体菌种接种器 edible mushroom liquid strain inocu
5、lator 将液体菌种按无菌操作要求接种到固体培养基物料上的工具。 3.3 空气压缩机 air compressor 能为食用菌液体菌种发酵生产提供压缩空气的设备。 3.4 空气过滤器 air filter 能对食用菌液体菌种发酵罐所用空气进行滤除杂菌和其他杂质，达到无菌洁净要求的设备。 3.5 DB37/T 3690.2 2019 2 罐压 jar pressure 在液体菌种制备过程中发酵罐内保持的空气压力（表压），单位： MPa。 3.6 通气量 ventilation volume 液体菌种培养过程中，发酵罐体积与每分钟通入发酵罐中无菌空气体积的 比例。用 V/V（发酵罐体 积 /通入
6、空气体积）表示。 3.7 接种量 inoculation amount 菌种体积与培养基体积的比例，用百分数表示。 3.8 液体菌种菌龄 period of liquid strain running 菌种接入培养基开始计算的液体菌种培养时间。 3.9 发酵罐空消 empty fermenter sterilization 对尚未加水投料的空发酵罐进行高压灭菌。 3.10 投料 feeding 将配置好的培养基投放到培养器中。 3.11 定容 constant volume 培养器中加入培养基后，加水至所要 求体积。 3.12 发酵罐实消 fermenter sterilization 对投料
7、后的发酵罐进行高压蒸汽灭菌。 3.13 罐压回零 jar pressure returning to zero 液体菌种培养过程中，发酵罐内压力回到零点。 3.14 摇瓶液体菌种 liquid spawn in flask 装在玻璃菌种瓶内在磁力搅拌器或摇床上恒温培养的液体菌种。 3.15 培养基起始 pH initial pH value of medium 液体培养基灭菌后尚未接种时的 pH。 DB37/T 3690.2 2019 3 4 基本要求 4.1 人员要求 工作人员应该保持个人卫生，进液体菌种发酵 车间必须穿戴经灭菌处理的工作服、口罩、鞋、帽。 4.2 产地环境要求 4.2.1
8、场所要求 生产场所应符合 NY/T 528的环境卫生要求，场地开阔、路面硬化、卫生清洁。 4.2.2 厂房要求 4.2.2.1 厂房设计应符合 NY/T 528 要求，设摇瓶菌种培养室、发酵罐菌种培养室。 4.2.2.2 应设置与职工人数相适应的更衣室，车间入口处应设置洗手、消毒和干手设施，过道应设置 风淋室。 4.2.2.3 车间地面应能防水、防腐蚀、防渗漏、防滑，易清洗，有适当的排水坡度（ 1.0 1.5） 和良好的排水系统。 4.2.2.4 墙壁和天花板应能防潮、防霉、防水。 4.2.2.5 门窗应设置防蚊蝇纱网。 4.2.2.6 车间安装排气管道或者排 风设备。 4.2.2.7 液体菌
9、种接种间应设置缓冲间。 4.2.2.8 摇瓶菌种培养室、发酵罐菌种培养室应符合 GB 50073 要求。 4.2.2.9 车间设封闭式废物桶。 4.3 生产设备与设施 4.3.1 生产设备与用具 应具有磅秤、天平、高压蒸汽灭菌锅、发酵罐、液体菌种接种器、超净工作台、调温设备、除湿设 备、恒温培养箱、恒温摇床或磁力搅拌器、冰箱、显微镜等及常规用具。压力容器应经政府有关部门检 验合格，符合 GB 150要求。应具有备用电源。 4.3.2 基本设施 培养基配制室、摇瓶菌种培养室、发酵罐菌种培养室规模要配套，布局合理，其中培养基配制室空 间洁净度应达到万级以上，摇瓶菌种培养 室、发酵罐菌种培养室要有调
10、温设施，空间洁净度应达到百级。 菌种检验室和母种制作室要有相应的实验检测设备和制种用的灭菌设施和常规用具。 5 生产技术 5.1 工艺流程 工艺流程见图 1。 图 1 黑木耳液体菌种生产工艺流程 5.2 品种选择 发酵培养 无菌空气 摇甁液体菌种 母种活化 基质 培养基配制 投料 灭菌 发酵罐液体菌种 发酵罐空消 接种 DB37/T 3690.2 2019 4 选用高产、优质、抗逆性强、商品性好的黑木耳品种，从具有相应资质的供种单位引种且种性清楚。 引种后必须进行适应性出耳试验验证。 5.3 母种活化 母种活化配方及操作流程应符合 NY/T 528要求。活化后母种质量应符合 GB 19169要
11、求 。 5.4 摇瓶液体菌种生产 5.4.1 容器 使用无色或近无色专用玻璃菌种甁，可用棉塞（梳棉或化纤棉）、硅胶塞、专用封口透气膜封口。 5.4.2 培养基配方 以配制 1 000 mL培养基计，马铃薯 200 g（煮汁），葡萄糖 20 g，蛋白胨 2 g，酵母粉 2 g，磷酸二 氢钾 1 g，硫酸镁 0.5 g， pH 自然。 生产用水应符合 GB 5749要求，培养基质应符合 NY/T 528要求。 5.4.3 培养基配制 以配制 1 000 mL培养基为例。选无青皮、未发芽的新鲜马铃薯洗净、去皮、去芽眼，切成 2 cm大小 的块状，加水煮沸，文火维持 30 min，用预湿的 4层纱布过
12、滤。再加入其余 的原料至溶解，定容。培养 基分装到摇瓶中，装液量为摇甁容量的 2/5 3/5，在摇瓶中放一粒转子，瓶塞封口，并用硫酸纸或牛皮 纸包扎。 5.4.4 灭菌 将分装好的摇瓶放入灭菌锅内，锅内留有一定的空隙。检查锅内水位，立即灭菌。压力升到 0.05 MPa 时，打开放气阀排除冷空气，如此重复一次。压力升至 0.10 MPa 0.12 MPa，恒压维持 35 min 40 min。 5.4.5 接种 待培养基冷却后于消毒过的超净工作台上，用经火焰消毒并冷却后的接种针挑取 7 8块（ 2 3） mm （ 2 3） mm的母种块迅速转接于待接种摇甁培养基内。 5.4.6 摇瓶菌种培养 接
13、种结束后封口，放入 26 28 恒温箱中静置培养 1 d，然后置于磁力搅拌器或恒温摇床上培 养，温度控制在 25 28 ，转速 140 r/min 160 r/min，培养时间 6 d 7 d。 5.4.7 摇瓶菌种质量标准 培养液澄清透明，无杂菌、无异味；镜检无杂菌、菌丝形态正常；菌丝球、菌丝片段密集，均匀悬 浮于液体培养基中，不分层，菌丝湿重 0.10 g/mL 0.13 g/mL。 5.5 发酵罐液体菌种生产 5.5.1 煮罐、空消 发酵罐初次使用、出现杂菌、长期放置、更换品种等情况出现其一时，应煮罐和空消。蒸气压力 0.15 MPa、温度 126 ，维持 40 min。 DB37/T
14、3690.2 2019 5 5.5.2 培养基配方 可选用以下配方： a) 配方 1：可溶性淀粉 30 g，葡萄糖 20 g，酵母膏 2 g，磷酸二氢钾 2 g，硫酸镁 1 g，消泡剂 0.3 g，水 1 L， pH 自然； b) 配方 2：玉米粉 20 g，葡萄糖 20 g，磷酸二氢钾 1.5 g，硫酸镁 0.75 g，消泡剂 0.3 g，水 1 L， pH 自然； c) 配方 3：马铃薯 200 g（煮沸取汁），葡萄糖 20 g，蛋白胨 2 g，酵母膏 2 g，磷酸二氢钾 1 g， 硫酸镁 0.5 g，消泡剂 0.3 g，水 1 L， pH 自然； d) 配方 4：豆饼 粉 15 g，葡萄
15、糖 20 g，玉米粉 10 g，酵母膏 2 g，磷酸二氢钾 2 g，硫酸镁 1 g， 消泡剂 0.3 g，水 1 L， pH 自然。 生产用水应符合 GB 5749要求，培养基质应符合 NY/T 528要求。豆饼粉、玉米粉应过 20目筛。 5.5.3 投料和定容 用水把淀粉、玉米粉等原料搅拌均匀，不能有结块，用吸管或漏斗通过上料口将原料加入罐体，装 液量为罐体容量的 70 % 80 %，加入 0.03 %消泡剂，通入空气搅拌 1 min 2 min，混合均匀，拧紧上料 口盖。 5.5.4 液体培养基灭菌 发酵罐加热层通入冷水，水位低于排水口 20 cm，关闭进、排水阀门加热。待加热层压力达到
16、0.05 MPa 时缓慢打开排气阀降压至 0 MPa，关闭排气阀，再次升压至 0.11 MPa；待发酵罐培养层压力达到 0.05 MPa 时缓慢打开排气阀降压至 0 MPa，关闭排气阀，再次升压至 0.11 MPa，同时打开空气过滤器灭菌，微开 排气阀，维持 40 min 50 min。 5.5.5 冷却 灭菌结束，关闭空气过滤器灭菌阀与排气阀，缓慢打开空气过滤器排水阀降压至 0 MPa，加热层通 入冷水降温；同时缓慢打开发酵罐培养层排气阀降压，待压力接近 0 MPa时向培养层内通入无菌空气， 调整 排气阀，维持罐压 0.04 MPa 0.05 MPa，培养液温度降至 25 以下时，关闭加热层
17、进水阀。 5.5.6 接种 接入摇甁菌种，接种量为 7 % 10 %。将发酵罐接种口用 75 %酒精消毒，用 95 %酒精的火焰圈套在 接种口上，轻微打开呼吸器阀门，使发酵罐压力为 0 MPa。点燃火焰圈，在火焰保护下用镊子去掉接种 管上的牛皮纸和棉塞，打开接种口阀门，将接种管插入接种口，将摇瓶菌种注入发酵罐。拔出接种管， 关闭接种阀门，去掉火焰圈，打开空气压缩机。 5.5.7 发酵罐菌种培养 根据菌丝生长情况，适时调节进气阀，通入适量无菌空气，同时调节 排气阀，维持罐压 0.01 MPa 0.03 MPa，温度控制在（ 25 1），培养 5 d 6 d。 5.5.8 液体菌种检测 5.5.8
18、.1 形态学观察。主要是通过肉眼观察菌球形态，通过显微镜观察菌丝体形态。 DB37/T 3690.2 2019 6 5.5.8.2 霉菌检验。按照无菌操作从取样阀取少量疑有霉菌污染的培养液，接种于 GB/T 4789.28 中规 定的 PDA 培养基中，置于 28 30 恒温培养 48 h，采用显微镜和感官观察菌丝生长状况和有无杂 菌污染；若出现白色以外的杂色者，或有异味者为霉菌污染物，必要时进行水封片镜检。 5.5.8.3 细菌检验。按照无菌操作从取样阀取少量疑有细菌污染的培养液， 接种于 GB/T 4789.28 中规 定的营养肉汤培养液中，置于 28 30 恒温培养 24 h 48 h，
19、观察培养液是否浑浊。培养液浑浊， 为有细菌污染；培养液澄清，为无细菌污染。 5.5.8.4 pH 测定。取样用 pH 计或 pH 试纸测定菌液酸碱度。 pH 小于 5 为不正常。 5.5.8.5 菌丝湿重测定。称取一定体积的培养液，经 5 000 r/min 离心 5 min，称重。 5.5.9 发酵罐液体菌种质量标准 5.5.9.1 感官要求 感官指标符合表 1的规定。 表 1 黑木耳发酵罐液体菌种感官要求 感 官 指 标 要 求 菌液色泽 菌丝球或菌丝片段呈白色，菌液呈浅棕色 菌液形态 菌液稍粘稠，有大量菌丝球或菌丝片段悬浮，分布均匀，不迅速分层，菌液不浑浊 菌液气味 有黑木耳液体培养时特
20、有的香气，无酸、臭等异味，发酵罐排气口气味正常，无明显改变 显微镜下 菌丝形态 可见黑木耳菌种液体培养中特有的菌丝形态，球状和丛状菌丝体大量分布，菌丝粗壮，无杂菌 5.5.9.2 理化指标 理化指标应符合表 2的规定。 表 2 黑木耳发酵罐液体菌种理化指标 理 化 指 标 要 求 pH 5.5 6.5 菌丝湿重（ g/mL） 0.10 0.15 6 贮存 黑木耳液体菌种生产后应立即使用，如不能立即使用，需进行贮藏。贮藏环 境温度应低于 20 。 发酵罐内液体菌种，持续通无菌空气，保持罐压 0.01 MPa 0.03 MPa，可存放 2 d。 7 生产档案 母种、摇瓶液体菌种和发酵罐液体菌种生产
21、的每个环节都要有详实的记录，记录内容按附录 A执行。 生产记录归档保存，至少两年。 DB37/T 3690.2 2019 7 A A 附 录 A （规范性附录） 黑木耳液体菌种生产记录事项 黑木耳液体菌种生产记录事项如下： a) 生产投入品使用情况（包括液体菌种的制作培养基质、营养辅料、所用菌种、菌瓶）： 1) 名称； 2) 来源； 3) 用法、用量； 4) 使用、停用的日期。 b) 菌种生产（培养基制作、灭菌、接种、培养）及杂菌发生情 况： 1) 培养基制作； 2) 高压灭菌； 3) 接种； 4) 培养。 c) 贮藏过程及杂菌发生情况； d) 主要菌种生产设备及用具： 1) 主要菌种生产设备； 2) 主要菌种生产用具。 e) 生产场所名称、菌种数量、记录人、入档日期。 _
