1、ICS 11.220 B 41 DB37 山东省 地 方 标 准 DB 37/T 3571 2019 牛副结核病干扰素 ELISA诊断技术 Diagnosis on bovine paratuberculosis by enzyme-linked immunoassay of -interferon 2019 - 05 - 29发布 2019 - 06 - 29实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 3571 2019 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 试验原理 . 1 5 试剂及仪器 . 1 5.1 材料 . 1 5
2、.2 仪器 . 2 6 检测方法 . 2 6.1 试剂配制 . 2 6.2 采血 . 2 6.3 全血培养 . 2 6.4 检测步骤 . 2 7 结果判定 . 2 7.1 样品结果计算 . 2 7.2 阴阳性结果判定标准 . 3 8 废弃物的处理 . 3 9 检测过程中防止交叉污染的措施 . 3 10 操作注意事项 . 3 附 录 A （资料性附录） 血液处理所需材料 . 4 附 录 B （资料性附录） ELISA试验所需试剂 . 5 附 录 C （资料性附录） 检测所需仪器 . 6 附 录 D （规范 性附录） 检测所用试剂的配制 . 7 DB37/T 3571 2019 II 前 言 本标
3、准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心。 本标准主要起草人：解晓莉、杨宏军、张亮、孙阳阳、程凯慧、楚会萌、刘来兴、杨美。 DB37/T 3571 2019 1 牛副结核病干扰素 ELISA诊断技术 1 范围 本标准规定了牛副结核病 干扰素 ELISA诊断技术的术语和定义、试剂及仪器、检测方法、结果判 定和操 作注意事项等。 本标准所规定的技术适用于牛感染副结核分枝杆菌时 干扰素的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日
4、期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 2008 实验室生物安全通用要求 GB/T 19495.2 2004 转基因产品检测 实验室技术要求 SN/T 1084 2010 牛副结核病检疫技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 牛副结核病 Paratuberculosis 一种由副结核分枝杆菌（禽分枝杆菌副结核亚种）引起的以慢性增生性、顽固性肠炎和进行性消瘦 为特征的慢性传染病，具有强烈的传染性，可垂直传播。 4 试验原理 被副结核分枝杆菌致敏的 T淋巴细胞再次受到相关抗原刺激后
5、可短时间内释放大量的 干扰素（ -Interferon），通过 干扰素的检测可实现对副结核分枝杆菌感染的诊断。 5 试剂及仪器 5.1 材料 5.1.1 血液处理所需材料 血液培养所需材料参见附录 A。 5.1.2 ELISA试验所需试剂 ELISA试验所需试剂参见附录 B。 DB37/T 3571 2019 2 5.2 仪器 检测所需仪器参见附录 C。 6 检测方法 6.1 试剂配制 检测所需试 剂及制备方法按附录 D的规定。 6.2 采血 血液的采集按 SN/T 1084 2010规定的方法执行。将采集的血液 (至少 5 mL)放入肝素抗凝管中，轻 轻颠倒 6 10次混合血液，使肝素溶解，
6、室温 (22 5 )下运送到实验室并在采血后 30 h内进行培养。 6.3 全血培养 6.3.1 血液分装 用一次性自动移液器在无菌条件下将抗凝血加入 24孔组织培养板，每份血分三孔， 1.5 mL/孔。 6.3.2 加入抗原 6.3.2.1 无菌操作下分别加入 100 L PBS(阴性抗原对照 )，禽结核提纯菌素（ A-PPD）及牛结核提纯 菌素（ B-PPD）至相应的孔。 6.3.2.2 用微量振荡器 高速振荡 1 min，将抗原与分装的血液充分混匀。或将细胞培养板及其盖紧紧 固定在一起，在光滑的表面上顺时针和逆时针各旋转 10次。 6.3.3 孵育 将组织培养板在 37 恒温培养箱中孵育
7、 16 h 24 h。 6.3.4 血浆样品收取及贮存 用可调移液器小心吸取约 400 L的上层血浆，转入新的 1.5 mL离心管中。吸取血浆时应尽量避免 吸入细胞。将盖子密封，表明时间、编号等信息，在 2 8 可贮存 7天，在 -20 可贮存数月。检 测前，样品应恢复至室温并充分混匀。 6.4 检测步骤 6.4.1 溶解冻干试剂，按“说明 10”平衡其他试剂。 6.4.2 按照商品化牛 IFN- 检测试剂盒说明书进行牛 IFN- 的 ELISA检测。 6.4.3 质量控制。按照试剂盒质量控制标准判断试验的有效性。如果试验中阴阳性对照结果有一条不 符合试验标准，试验则视为无效，应重新检测。 7
8、 结果判定 7.1 样品结果计算 计算每个样品阴性抗原、 A-PPD和 B-PPD的平均 OD值。 DB37/T 3571 2019 3 7.2 阴阳性结果判定标准 A-PPD与 PBS OD值的差值 0.35，且与 B-PPD OD值的差值 0.25时，判为阳性； A-PPD与 PBS OD值的差值 0.35，或与 B-PPD OD值的差值 0.25时，判为阴性。 8 废弃物的处理 按照 GB 19489 2008的规定执行。 9 检测过程中防止交叉污染的措施 按照 GB/T19495.2 2004的规定执行。 10 操作注意事项 10.1 除 100倍浓缩的结合物外，所有待检血浆和试剂在使
9、用前应恢复至室温 (22 5 )。解冻的 样品需小心涡旋，充分混和。加热的温度不应超过 37 。室温水浴箱可缩短平衡时间。 10.2 试剂盒内所有试剂均应储存于 2 8 ，使用完后即放回 2 8 低温冰箱中。放于室温 (22 5 )的工作浓度的洗液应两周内用完。 10.3 100倍浓缩的结合物和稀释后的结合物应放置在 2 8 低温冰箱中。 10.4 为保证试验效果，应使冻干试剂完全溶解，溶解后的试剂至少需放置 15 min，然后轻轻颠倒混 合 4 5次；也可以使用滚动振荡装置混合。使用前需再次混匀。 10.5 采用去离子水或双蒸水溶解或稀释试剂。 DB37/T 3571 2019 4 A A
10、附 录 A （资料性附录） 血液处理所需材料 肝素真空管 10 mL或 20 mL注射器 无菌的 24孔组织培养板 100 1 000 L吸头 1.5 mL离心管 Bovigam牛型提纯结核菌素 (B-PPD)， 300头动物 1支 Bovigam禽型提纯结核菌素 (A-PPD)， 300头动物 1支 无菌的磷酸盐 缓冲液（ 0.01M pH7.2） DB37/T 3571 2019 5 B B 附 录 B （资料性附录） ELISA试验所需试剂 酶标板 (包被 IFN- 抗体 ) 牛 干扰素阳性对照 (含 0.01 %的硫柳汞 ) 牛 干扰素阴性对照 (含 0.01 %的硫柳汞 ) 样品稀释
11、液 (血浆稀释缓冲液，含 0.01 %硫柳汞） 20倍洗液 (含 0.01 %的硫柳汞 ) 100倍酶标结合物 (含 0.01 %的硫柳汞 ) 酶标抗体稀释液 (酶标结合物稀释缓冲液，含 0.0l %的硫柳汞） 底物缓冲液 (含 H2O2) 100倍浓缩的显色剂溶液 (含溶于 DMSO的 TMB） 终止液 (0.5 M H2SO4) DB37/T 3571 2019 6 C C 附 录 C （资料性附录） 检测所需仪器 37 培养箱 精密可调移液器（ 200 L、 1 mL） 1 mL、 5 mL、 10 mL的移液器 100 mL、 1 L、 2 L的量筒 12道移液器 (50 L-300
12、L) 微量振荡器 洗板机 酶标仪 (含 450 nm和 650 nm滤光片 ) DB37/T 3571 2019 7 D D 附 录 D （规范性附录） 检测所用试剂的配制 D.1 抗原 牛型提纯结核菌素和禽型提纯结核菌素在使用前彻底混匀，独立分装 (0.3 mg/mL）。 D.2 酶标板 酶标板在未开封前恢复至室温，可放 置 30 min以上。 D.3 阳性对照和阴性对照 用 1 mL去离子水或蒸馏水溶解阴、阳性对照。应保证完全溶解，溶解的阴阳性对照在 3个月内可储 存于 2 8 ，但再次使用前应恢复至室温并充分混匀。 D.4 样品稀释液 恢复至室温并充分混匀，用作血浆稀释缓冲液。 D.5
13、酶标结合物 用 0.5 mL去离子水或蒸馏水溶解 100倍浓缩的冻干酶标结合物。 100倍浓缩的酶标结合物必须一直保 存于 2 8 ，溶解后的酶标结合物应在 3个月内用完。酶标抗体稀释液可直接使用。按表 D.1配制酶 标结合物工作液，配制完后应在 5 min内使用，未用完的试剂 应立即丢弃。未用完的 100倍浓缩的酶标结 合物应立即放回至 2 8 条件下保存。 表 D.1 酶标结合物配制表 酶标板数量 浓缩酶标结合物 (100倍 )的体积 酶标抗体稀释液的体积 1 0.12 mL 12 mL 2 0.24 mL 24 mL D.6 洗液 配制工作浓度的洗液，将 19份去离子水或蒸馏水加入 1份 20倍浓缩的洗液中，充分混匀。工作浓度 的洗液可在室温贮存 2周，未用完的 20倍浓缩洗液应放回至 2 8 条件下保存。 20倍浓缩洗液可能 含有结晶盐，如出现结晶，应于 37 重新溶解结晶。 D.7 底物溶液 DB37/T 3571 2019 8 将底物缓冲液和 100倍显色剂溶液恢复至室温，稀释前充分混匀。底物溶液的配制见表 D.2。底物溶 液应充分混匀且应当是无色的，如出现蓝色应丢弃。配制完后应在 10 min内使用。 表 D.2 底物配制表 酶标板数量 浓缩显色剂 (100倍 )的体积 底物缓冲液的体积 1 0.12 mL 12 mL 2 0.24 mL 24 mL
