1、ICS 65.020.01 B 40 DB37 山东省 地 方 标 准 DB 37/T 3560 2019 荷斯坦牛致死单倍型（ HH1、 HH3、 HH4和 HH5） 基因检测技术规程 Code of practice for molecular detection of lethal haplotypes (HH1, HH3, HH4 and HH5) in Holstein 2019 - 05 - 29发布 2019 - 06 - 29实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 3560 2019 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定
2、义 . 1 4 检测原理 . 2 4.1 荷斯坦牛致死单倍型 HH1、 HH3和 HH4的检测 . 2 4.2 荷斯坦牛致死单倍型 HH5的检测 . 2 5 主要试剂 . 2 6 主要仪器设备 . 2 7 检测方法 . 2 7.1 样本采集 . 2 7.2 DNA提取 . 2 7.3 DNA浓度和纯度检测 . 3 7.4 引物序列 . 3 7.5 PCR扩增 . 3 7.6 PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测 . 3 7.7 测序分析 . 3 8 结果判定 . 3 8.1 致死单倍型 HH1测序结果判定与表述 . 3 8.2 致死单倍型 HH3测序结果判定与表述 . 4 8.3 致死单倍型 HH4测
3、序结果判定与表述 . 4 8.4 致死单倍型 HH5扩增条带判定与表述 . 5 9 废弃物的处理 . 5 10 检测过程中防止交叉污染的措施 . 5 附 录 A （资料性附录） 主要试剂 . 6 附 录 B （资料性附录 ） 主要仪器设备 . 7 附 录 C （规范性附录） PCR扩增产物 . 9 DB37/T 3560 2019 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、山东省畜牧总站、威海市畜牧兽医局、山东奥 克斯畜牧种业有限公司、
4、江苏省农业科学 院畜牧研究所。 本标准主要起草人：黄金明、鞠志花、王秀革、张思聪、赵国清、高亚平、魏晓超、姜强、刘文浩、 张亚冉、李荣岭、李建斌、高运东、曲绪仙、侯明海、仲跻峰。 DB37/T 3560 2019 1 荷斯坦牛致死单倍型（ HH1、 HH3、 HH4和 HH5）基因检测技术规程 1 范围 本标准规定了荷斯坦牛四种致死单倍型（ HH1、 HH3、 HH4和 HH5）的检测方法和结果判定。 本标准适用于荷斯坦牛四种致死单倍型（ HH1、 HH3、 HH4和 HH5）的检测与诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用
5、于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19495.2 2004 转基因产品检测 实验室技术要求 GB/T 27642 2011 牛个体及亲子鉴定微卫星 DNA法 NY/T 1672 2008 绵羊多胎主效基因 FecB分子检测技术规程 NY/T 2695 2015 牛遗传缺陷基因检测技术规程 DB37/T 2037 2012 牛白细胞黏附缺陷症（ BLAD）基因分子检测技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本 文件。 3.1 荷斯坦致死单倍型 1 Holstein lethal ha
6、plotype 1， HH1 由牛第 5号染色体的凋亡蛋白酶激活因子 1（ Apoptotic protease-activating factor 1， APAF1） 基因产生的终止突变（ g.63150400C T； rs448942533；牛参考基因组 UMD 3.1）引起的一种隐性遗传缺 陷。当突变等位基因纯合时，个体致死，大多数表现为妊娠早期流产，不易被观察，在健康奶牛群体中 无纯合的 HH1单倍型。 3.2 荷斯坦致死单倍型 3 Holstein lethal haplotype 3， HH3 由牛第 8号染色体的染色体结构维持 2（ Structural maintenance
7、of chromosomes 2， SMC2）基因 一个错义突变（ g.95410507T C； rs456206907；牛参考基因组 UMD 3.1）引起的一种隐形遗传缺陷，与 乳蛋白、繁殖年限、青年牛受胎率、母牛受胎率有关 ,当突变的等位基因纯合时致死。 3.3 荷斯坦致死单倍型 4 Holstein lethal haplotype 4， HH4 DB37/T 3560 2019 2 由牛 1号染色体的磷酸核糖甘氨酰胺转甲酰基酶（ Phosphoribosylglycinamide formyltransferase, GART）基因的一个错义突变（ g.1277227A C； rs46
8、5495560；牛参考基因组 UMD 3.1）引起的隐性遗传 缺陷。 HH4导致流产，与产奶、乳蛋白和繁殖力有关，无纯合子个体。 3.4 荷斯坦致死单倍型 5 Holstein lethal haplotype 5， HH5 由牛 9号染色体的线粒体转录因子 B1（ Transcription factor B1, mitochondrial, TFB1M）基因缺 失 138.348 kb的区域（ 93232651 bp至 93370998 bp；牛参考基因组 UMD 3.1）造成的一种隐性遗传缺陷， 携带者影响乳蛋白量和女儿妊娠率，无纯合子个体。 4 检测原理 4.1 荷斯坦牛致死单倍型 H
9、H1、 HH3和 HH4的检测 根据牛 APAF1、 SMC2和 GART基因的因果突变设计特异引物，进行 PCR扩增，对扩增产物进行测序分析， 根据 DNA测序的峰图及碱基序列比对结果，判断其基因型，确认是否携带致死单倍型。 4.2 荷斯坦牛致死单倍型 HH5的检测 根据牛 TFB1M基因的缺失序列，首先在牛 TFB1M基因缺失序列中设计一对引物，进行 PCR扩增，携 带 者与正常者均可扩增出目的条带。其次在牛 TFB1M基因缺失序列两端设计一对引物，进行 PCR扩增，携带 者可扩增出目的条带，正常者因扩增片段太长，检测时无条带。最后根据两对引物的 PCR扩增产物电泳 条带，对致死单倍型 H
10、H5携带者和正常者综合进行判断。 5 主要试剂 除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合 GB/T 6682规定的双蒸水；高压灭菌条件为 121 ， 1.034 105 Pa压力，蒸汽灭菌 20 min。主要试剂见附录 A。 6 主要仪器设备 见附录 B。 7 检测方法 7.1 样本采集 颈静脉采集血样 3 mL 5 mL， ACD抗凝， -20 保存。对公牛，亦可采集 2 3剂细管精液（ 0.25 mL 或者 0.5 mL规格），液氮保存。 0.1 g 0.3 g组织（耳组织、肌肉）或带毛囊的牛毛浸入 75 %的酒精， -20 保存备用。 7.2 DNA提取 7.2.1 血液 DNA的提取
11、血液 DNA提取按 DB37/T 2037 2012中 7.2.1规定的方法执行。 DB37/T 3560 2019 3 7.2.2 精液 DNA提取 精液 DNA提取按 DB37/T 2037 2012中 7.2.2规定的方法执行。 7.2.3 组织和带毛囊的牛毛 DNA提取 组织和带毛囊的牛毛 DNA的提取按 GB/T 27642 2011中附录 B规定的 方法执行。 7.3 DNA浓度和纯度检测 按照 NY/T 1672 2008的规定执行。 7.4 引物序列 7.4.1 致死单倍型 HH1: APAF1基因 上游引物 5- ATTTGTTACCTAATGGTTGGC-3；下游引物 5-
12、 TGCTACCTGAGAAATAATGAC-3。扩增产物为 393 bp。 7.4.2 致死单倍型 HH3: SMC2基因 上游引物 5- TTTCTATAACTATCTTCCAGC-3；下游引物 5- ACAGTCTTGTTTTGATTGTGC-3。扩增产物为 596 bp。 7.4.3 致死单倍型 HH4: GART基因 上游引物 5- CCCATAGATGGCAGCCCACCAG-3；下游引物 5- GACCACAGTTACGGCAGCACAG-3。扩增产物为 646 bp。 7.4.4 致死单倍型 HH5: TFB1M基因 引物 1，上游引 物 1 5- GATATTCATTCTGT
13、AAACACTCA-3；下游引 物 1 5- CTTGCCCACGCTTTTACTCTA-3，扩增产物为 478 bp；引物 2，上游引物 2 5- CAAACATAAACTTACCTGAC-3；下游引物 2 5- AATAAGTAGCAATCTGTCCT-3，扩增产物为 508 bp。 7.5 PCR扩增 7.5.1 PCR扩增体系 PCR mix 12.5 L、 10 mol/L引物各 1.0 L、模板 DNA 50 100 ng，加双蒸水至总体积 25 L。 7.5.2 PCR扩增循环参数 94 预变性 5 min。 94 变性 30 s， 52 61 退火 30 s（ HH1 52 ；
14、 HH3 50 ； HH4 61 ； HH5 引物 1 52 /引物 2 55 ）， 72 延伸 30 s， 35个循环。 72 延伸 7 min， 4 保存。 7.6 PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测 按 NY/T 2695 2015中 6.4.2的规定执行。 7.7 测序分析 将致死单倍型 HH1、 HH3和 HH4扩增的 PCR产物直接进行测序分析。 8 结果判定 8.1 致死单倍型 HH1测序结果判定与表述 8.1.1 PCR扩增的 APAF1基因片段测序结果见附 录 C.1。如图 1所示，将 PCR产物测序结果利用 DNAstar 软件进行比对， APAF1基因 PCR扩增产物的第 26
15、8位碱基为 C时，且测序峰图为单峰，表明是纯合基因 型 CC，该个体表述为正常牛。 DB37/T 3560 2019 4 8.1.2 APAF1基因 PCR扩增产物的第 268位碱基为 C或 T时，且测序峰图为套峰，表明是基因型 CT， 属于杂合子， 该个体表述为致死单倍型 HH1携带牛。 图 1 牛 APAF1基因 PCR产物测序结果 8.2 致死单倍型 HH3测序结果判定与表述 8.2.1 PCR扩增的 SMC2基因片段测序结果 见附录 C.2。如图 2所示，将 PCR产物测序结果利用 DNAstar 软件进行比对， SMC2基因 PCR扩增产物的第 264位碱基为 C时，且测序峰图为单峰
16、，表明是纯合基因 型 CC，该个体表述为正常牛。 8.2.2 SMC2基因 PCR扩增产物的第 264位碱基为 C或 T时，且测序峰图为套峰，表明是基因型 TC，属 于杂合子，该个体表述为致死单倍型 HH3携带牛。 图 2 牛 SMC2基因 PCR产物测序 结果 8.3 致死单倍型 HH4测序结果判定与表述 8.3.1 PCR扩增的 GART基因片段测序结果 见附录 C.3。如图 3所示，将 PCR产物测序结果利用 DNAstar 软件进行比对， GART基因 PCR扩增产物的第 337位碱基为 A时，且测序峰图为单峰，表明是纯合基因 型 AA，该个体表述为正常牛。 8.3.2 GART基因
17、PCR扩增产物的第 337位碱基为 A或 C时，且测序峰图为套峰，表明是基因型 AC，属 于杂合子，该个体表述为致死单倍型 HH4携带牛。 图 3 牛 GART基因 PCR产物测序结果 DB37/T 3560 2019 5 8.4 致死单倍型 HH5扩增条 带判定与表述 8.4.1 首先在缺失序列中设计一对引物 1，进行 PCR扩增， PCR扩增的 TFB1M基因序列 1见附录 C.4。 如图 4 A所示，正常者与携带者均可扩增出 478 bp条带。其次在缺失序列两端设计一对引物 2，进行 PCR扩增， PCR扩增的 TFB1M基因序列 2见附录 C.5。如图 4 B所示，正常者因片段太长扩增
18、不出条带， 携带者可扩增出 508 bp条带。 8.4.2 最后根据两对引物的 PCR扩增产物电泳条带，对致死单倍型 HH5携带牛和正常牛综合进行判断。 在图 4 A引物 1 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果中显示 478 bp条带，在图 4 B引物 2 PCR扩增产物 琼脂糖凝胶电泳结果中 无条带，该个体表述为正常牛。在图 4 A引物 1 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结 果中显示 478 bp条带，在图 4 B引物 2 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果中显示 508 bp条带，该个体 表述为致死单倍型 HH5携带牛。 注： A，牛 TFB1M基因引物 1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测结果；
19、B，牛 TFB1M基因引物 2 PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测 结果。 图 4 牛 TFB1M基因 PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果。 9 废弃物的处理 按照 GB/T 19495.2的规定执行。 10 检测过程中防止交叉污染的措施 按照 GB/T 19495.2的规定 执行。 DB37/T 3560 2019 6 A A 附 录 A （资料性附录） 主要试剂 A.1 PCR mix A.2 75 %酒精 A.3 ACD抗凝剂 柠檬酸 0.48 g、柠檬酸钠 1.32 g、葡萄糖 1.47 g，定容于 100 mL水中，高压灭菌。 A.4 10 mg/mL溴化乙锭 在 10 mL水中加入 100 m
20、g的溴化乙锭（ EB），溶解后分装成 1 mL小份， 4 保存。 A.5 50 TAE缓冲液 Tris-base 242 g，冰乙酸 57.1 mL， 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)100 mL，加水定容至 1 000 mL。 A.6 1 %的琼脂糖 1 g琼脂糖充分 溶解于 1 TAE，定容至 100 mL。 A.7 琼脂糖电泳上样缓冲液 0.25 %溴酚兰； 0.25 %二甲苯菁 FF； 40 %的蔗糖水溶液。 DB37/T 3560 2019 7 B B 附 录 B （资料性附录） 主要仪器设备 B.1 单道可调移液器 2 L， 10 L， 20 L， 100 L， 200
21、 L， 1 000 L。 B.2 PCR扩增仪 温度范围 4 99 ，温度梯度范围 20 ，模块单元 96 0.2 mL。 B.3 离心机 最高转速 12 000 r/min，最大容量 24 1.5 mL。 B.4 电子天平 量程 0.001 g 100 g，感量 0.001 g。 B.5 旋涡混合器 转速 2 800 r/min，工作台直径 110 mm。 B.6 凝胶成像分析系统 有效像素 1280 1024，检测灵敏度 DNA 0.05 ng。 B.7 稳压稳流电泳仪 输出电压 0 600 V，输出电流 0 100 mA。 B.8 水平电泳槽 外形尺寸 182 mm 85 mm 5 mm
22、，凝胶板面积 60 mm 60 mm。 B.9 高压灭菌锅 使用温度范围 45 135 ，最高使用压力 0.255 Mpa。 B.10 自动双重纯水蒸馏器 DB37/T 3560 2019 8 功率 3 000 W，出水量 2 500 mLh。 B.11 微波炉 容积 20 L，尺寸 262 mm 452 mm 365 mm。 B.12 干燥箱 温控范围 50 300 ，箱内尺寸 350 mm 350 mm 450 mm。 B.13 冰箱 4 ， -20 。 DB37/T 3560 2019 9 C C 附 录 C （规范性附录） PCR扩增产物 C.1 PCR扩增的奶牛 APAF1基因序列（
23、用于 HH1分析） 1 ATTTGTTACCTAATGGTTGGCTATTTAATTTTAGCTCATATAGAGAATATTTAAGCCTTT 61 AAAGTGACAAGATCACAGAAACAGAAAAATGTCTGATCTTGGCTCTGGTTATGTTTCTAA 121 GCAATTCCATTTTGTTCATAGGATGGTATAGACTGTGAGAATTTCCAGGAGTTTTTATCT 181 TTAAATGGACATCTTCTTGGACGACAGCCATTTCCTAATATTGTGCAACTGGGCCTCTGT 241 GAACTGGAAACTTCAGAGGTTTATCGGT/
24、CAAGCTAAGCTGCAGGCCAAGCAGGAGGTCGAT 301 AACGGAATGCTTTACCTGGAGTGGGTGTAAGTAGGTTAGGAGAGAAACCAGAGGGAGCAG 361 AGCGCTGACTATGTCATTATTTCTCAGGTAGCA 注： T/C 表示扩增片段的第 268位点 SNP突变 C.2 PCR扩增的奶牛 SMC2基因序列（用于 HH3分析） 1 TTTCTATAACTATCTTCCAGCTAAATCAGCACTCTTCATAATAATAGGGTAGCAGATTTG 61 CTTCAGCGCTTTGGCAAAAAGTGGTAAAATCAAGTTT
25、TGATGGTATTTCTTTTGGCCTTC 121 TTTTTTCAGGTCTTTAGTGGCTCTGTCATTAATCCTGTCCATGCTCCTTTTCAAACCTGC 181 CCCAATCTACATCCTGGATGAGGTCGATGCAGCCCTGGATCTTTCTCATACTCAGAATAT 241 TGGACATATGCTACGTACTCATTT/CCACACATTCTCAGGTAAGAACCAAAAAGAGCCTCAG 301 AATAGTTCTAGGATTTGTTTTTCTAAAACTATTCTTTAGTAATGGTCAGTATATATAAGG 361 AATTTAGGAT
26、TGAAGAATACCAAGGTGTTGTATATCTCTTTAAATATATAATTCTATTCA 421 TATGGTTCCAGAAGGAAAGAGGCTTTCATCTCTTATTAAAGAAAGAGCCTGGAATTACAA 481 TAGCAGGTTATAGCATGAAGAGGAATCTATTTTTTTTTTTTTGTCACTTGAAATTATTTA 541 GGTTAATTATTTTCTCTAGCTAGCTGAGAGAAGATGCACAATCAAAACAAGACTGT 注： T/C 表示扩增片段的第 264位点 SNP突变 C.3 PCR扩增的奶牛 GART基因序列（用于 HH4分析
27、） 1 CCCATAGATGGCAGCCCACCAGGCTCCGCCATCCCTGGGATTCTCCAGGCAAGAACACTG 61 GAGTGGGTTGCCATTTCCTTCCCCCATGCATGAAAGTGAAAAGTGAAAGTGAAGTTGCCC 121 AGTCGTGTCTGACTCTTAGCGACCCCATGGACTGCAGCCTACCAGGCTCCTCCATCCATG 181 GGATTTTCCAGGCAAGAGTACTGGAGTGGGGTGCCATTGCCTTCTCCGAGTCACAGTACA 241 ATGTCTGCATTAACGATTTTTTTTTCTTTTTTAATGA
28、AGGTGTCCTCTATGCTGGTATAA 301 TGCTGACCAAGAACGGCCCCAAAGTTCTGGAATTTAA/CTTGCCGTTTCGGTGATCCAGAGT 361 GCCAAGTGAGTAAAAAAAGATGCGTGCTATTTTAATCTTAGGATTTTTCAGCCTTGAAAT 421 AATTATTACCTTTGAGAAATATAATGCAAATTCTGATATTTCAGTGAATAAAATGTCCCA 481 GGAGAATTGAAATTTCTCTCAGTTGTCATACTGATTGTGTTTTTTCCAGGTGATCCTCCC 541 ACTTCTTAAA
29、AGTGATCTTTATGAAGTGATTCAGTCTATCTTAGATGGCTTGCTCTGCAC DB37/T 3560 2019 10 601 TTCTCTGCCTGTTTGGCTGGACAACTGTGCTGCCGTAACTGTGGTC 注： A/C 表示扩增片段的第 337位点 SNP突变 C.4 PCR扩增的奶牛 TFB1M基因序列 1（用于 HH5分析） 1 GATATTCATTCTGTAAACACTCATGAAACCAGCCCCTTTGTACTAGAGCTGAAGTGGGAT 61 ATGAGAGTGAATGAACAAGGCCAAGTCTGTCCCCAAGGAGCTTACATTT
30、TAGTCAGTTTG 121 CTTTCCCACTCCCTAAGTCACGTTTTATGAAGTAAAATTTAGACACAAAAAAATTCACCT 181 GTTTGAAGCGCACAGTTGGATAAATTTTGCAAATATATATATATTGTCGTTTAACCTCTA 241 CCAGCGTTTTTTCGTGCTGGTCTTTCTGAAAGATGATACTGCAAGAAAAAGATTATTAGA 301 AATATGGCAGTTCACAGTTGGAGTATGTAACATTTCTGGGGTTTTGATATTTCATTCTAT 361 TTGGCCCCTCTTAAGAAACTGAGT
31、CAGTAAATCACATATTTCGAAAGTTGTGAAGTACAG 421 TCCAACAGCAGGGATGGGTGGTTTTATTTCTTGAACTTAGAGTAAAAGCGTGGGCAAG C.5 PCR扩增的奶牛 TFB1M基因序列 2（用于 HH5分析） 1 CAAACATAAACTTACCTGACAAGAATTATGTAAGGTGATTTGATAATTAGCAAACATTTA 61 CAAAGAGACATTTTTAATTTGGTAGAAATAACATGTTCCTAAATAGGAATATTAAGCATA 121 CCAAAAATATTGATTTGTTCCAAGTTAATTAATA
32、GATTAAATAAAATTACAATCAAAATT 181 TAAATTCTCTTTAAAACTTTTTGAAATACTAGATATGCTAAAGTTTACCTAGAAGAATAT 241 ATAAGCAAGAAGAAGCAAAAAAAAAGTGAAAAGGAAAAGAGAAGAAAGAAAGAAAAAAGG 301 AGAAGAAAGAAAGAAGAACAGAACAGAAAGAAAGAGAAGATAAGAAAGAGAAAAGGAAAT 361 TCAGCATCCAGAAGCATCATTGTATGAATGGTTCTATGAAGACCTACAAGACATTTTAGA 421 ACCTACACCATACCATTCACAAAATTCATAGAGCAAAACAAACCAGTATTTTTTTTTTCC 481 ACTGACCTAGGACAGATTGCTACTTATT _
