1、ICS 11.220 B 41 DB37 山东省 地 方 标 准 DB 37/T 3625 2019 牛羊养殖场气溶胶布鲁氏菌荧光定量 PCR 鉴别检测技术规程 Differential detection of Brucella pathogenic organisms in aerosol of cattle and sheep farm by Real-time PCR 2019 - 07 - 23发布 2019 - 08 - 23实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 3625 2019 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语与定义
2、. 1 4 缩略语 . 1 5 原理 . 1 6 材料及设备 . 1 6.1 试剂 . 1 6.2 仪器设备 . 2 7 生物安全措施 . 2 8 气溶胶样品的采集、保存及运输 . 2 8.1 气溶胶样品的采集 . 2 8.2 气溶胶样品的采集后的灭活处理 . 2 8.3 样品的保存和运输 . 2 9 操作方法 . 2 9.1 气溶胶样本的前处理 . 2 9.2 核酸提取 . 3 9.3 荧光定量 PCR检测 . 3 10 分析条件设定和结果判定 . 3 10.1 阈值设定 . 3 10.2 质控 . 3 10.3 结果分析及判定 . 3 11 注意事项 . 4 附 录 A （资料性附录） 主
3、要仪器设备 . 5 附 录 B （规范性附录） 牛羊养殖场环境气溶胶样本的采集方法和注意事项 . 6 附 录 C （资料性附录） 气溶胶布鲁氏菌核酸荧光定量 PCR鉴别诊断结果图 . 8 附 录 D （规范性附录） 检测过程防止交叉污染的措施 . 11 DB37/T 3625 2019 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。 本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛 研究中心、山东师范大学。 本标准主要起草人：何洪彬、赵贵民、王洪梅、侯佩莉、马文青、何成强、程凯慧、杨宏军、张亮、
4、 解晓莉。 DB37/T 3625 2019 1 牛羊养殖场气溶胶布鲁氏菌荧光定量 PCR鉴别检测技术规程 1 范围 本标准规定了牛羊养殖场环境气溶胶样本中布鲁氏菌核酸荧光定量 PCR鉴别诊断方法。 本标准适用牛羊养殖场环境中气溶胶布鲁氏菌核酸的检测以及牛种、羊种和猪种布鲁氏菌核酸的鉴 别检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所 有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 3 术语与定义 下列术语和
5、定义适用于本文件。 3.1 Ct值 Cycle Threshold 荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 AGI：全玻璃液体冲击式采样器（ All-Glass-Impinger） 5 原理 本标准采用 SYBR Green I染料实时荧光定量 PCR技术。 布鲁氏菌 IS711（ Insertion Sequence 711， IS711）插入序列在 不同种的布鲁氏菌基因组中高度保 守，仅在拷贝数上存在差异。一条引物锚定在 IS711上，另一条引物分别选在不同种布鲁氏菌 IS711插入 序列邻近的上下游单染色体 DNA上，可以用来鉴别布鲁氏菌种的特异
6、性。 6 材料及设备 6.1 试剂 6.1.1 试剂级别 DB37/T 3625 2019 2 检测中使用的试剂均为分析纯，实验室用水应符合 GB/T 6682的要求。 6.1.2 引物序列 通用型上游引物（ Brucella-F）： 5 -TCTTTGTCGTGGGCTTCATCG-3。 通用型下游引物（ Brucella-R）： 5 -TGGTCTGCACCATCGTCTTGTC-3。 牛种上 游引物（ Abortus-F）： 5 -ACCATTGAAGTCTGGCGAGCA-3。 羊种上游引物（ Melitensis-F）： 5 -TCGCTGTCACTGTTGCAAGTATG-3。 猪
7、种上游引物（ Suis-F）： 5 -AAAGGGAGTGGGTTCTAGGGCG-3。 牛、羊和猪种下游共用 IS711-R： 5 -GACCGCATTCATGGGTTTCG-3。 引物在使用时用灭菌双蒸水稀释成 10 mol/L工作液，置于 -20 保存。 6.1.3 主要组分 SYBR Green I荧光定量 PCR反应 缓冲液，采用商品化试剂。 6.1.4 对照设置 阳性对照均为疫苗株灭活后提取的核酸样本，有牛种布鲁氏菌 A19疫苗株基因组 DNA、羊种布鲁氏菌 M5疫苗株基因组 DNA和猪种布 鲁氏菌 S2疫苗株基因组 DNA， -20 保存备用。阴性对照为采集自无布鲁氏 菌污染的净
8、化健康牛场气溶胶样本提取的基因组 DNA。 6.2 仪器设备 仪器设备及参数见附录 A。 7 生物安全措施 为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测布鲁氏菌核酸，所有检测样本应严格在 级生物安全柜内操作。 8 气溶胶样品的采集、保存及运输 8.1 气溶胶样品的采集 应用空气微生物采样箱 ，使用国际标准的 AGI采集样本。采集方法与注意事项见附录 B。 8.2 气溶胶样品的采集后的灭活处理 样品采集后立即用 2%石碳酸溶液灭活处理。 8.3 样品的保存和运输 待检样品在 2 8 保存不应超过 24 h； -20 保存不超过三个月； -80 以下可长期保存。样 品应置于低温（ 2 8
9、）、密封的容器内运输。 9 操作方法 9.1 气溶胶样本的前处理 DB37/T 3625 2019 3 取 30 mL采集的气溶胶样本， 12 000 r/min离心 10 min，弃上清，重悬沉淀物，继续进行核酸提取， 或置 -20 备用。 9.2 核酸提取 采用商品化细菌基因组 DNA提取试剂 盒进行核酸提取。 9.3 荧光定量 PCR检测 9.3.1 反应液的配制 采用 20 L反应体系，每个反应管包含荧光定量 PCR反应液（ 2）： 10.0 L，上、下游引物各 0.8 L，灭菌蒸馏水 6.4 L，检测模板与阴、阳性对照分别为 2 L。需要配制的荧光定量 PCR反应液管数 为样品个数
10、n+2（阳性对照） + 2（阴性对照） +2（防止分装时液体损失）。按照顺序依次加入上述各荧 光定量 PCR反应组份的预混液，然后在每个 PCR反应管中分装 18 L。 9.3.2 加样 在已分装有荧光 PCR预混液的 PCR反应管中每管分别加入 2 L待测样品或对照 模板，混匀，盖上管 盖，放入荧光 PCR仪，记录样品放置顺序。 9.3.3 荧光定量 PCR扩增 选择检测模式： SYBR Green I。反应体系： 20 L。反应条件设定：预变性： 95 30 s， 1个循 环； PCR扩增： 95 5 s， 61 30 s， 40个循环， 61 时采集荧光信号。熔解曲线： 95 15 s，
11、 65 1 min， 95 ， Continuous； 40 10s。可根据不同品牌 PCR仪器说明书等效设置参数。 10 分析条件设定和结果判定 10.1 阈值设定 综合分析仪器给出的各项结果，基线（ Baseline）以仪器给出的默认值作为参考，阈值（ Threshold） 设定原则以阈值线刚好超过阴性对照样品扩增曲线的最高点为准，具体需根据仪器噪声情况进行调整， 选择 PCR扩增反应所设定的荧光基团对应的通道进行分析。 10.2 质控 质控有效的条件为：阴性对照和空白对照应无 Ct值或 35，阳性对照的 Ct值应 35，且呈现 S型扩 增曲线。 10.3 结果分析及判定 布鲁氏菌核酸阴性
12、反应结果判定：检测结果呈现无 Ct值、无扩增曲线、扩增反应曲线无明显对数增 长期，判为荧光定量 PCR阴性反应，样品判定为布鲁氏菌核酸检测阴性。 布鲁氏菌核酸阳性反应结果判定 ：检测结果呈现 Ct值 35、扩增曲线有明显的对数增长期，且熔解 曲线的 Tm值为（ 84.6 0.5）：判定为荧光定量 PCR结果阳性反应，样品判为布鲁氏菌核酸检测阳性。 牛种布鲁氏菌核酸阳性反应结果判定：牛种布鲁氏菌检测结果呈现 Ct值 35、且扩增曲线有明显的 对数增长期，同时 Tm值为：（ 87.8 0.5）。见附录 C。 羊种布鲁氏菌核酸阳性反应结果判定：羊种布鲁氏菌检测结果呈现 Ct值 35、且扩增曲线有明显
13、的 对数增长期，同时 Tm值为：（ 86.7 0.5）。见附录 C。 DB37/T 3625 2019 4 猪种布鲁氏菌核酸阳性反应结果判定：猪种布鲁 氏菌检测结果呈现 Ct值 35、且扩增曲线有明显的 对数增长期，同时 Tm值为：（ 84.5 0.5）。见附录 C。 11 注意事项 注意的事项见附录 D。 DB37/T 3625 2019 5 A A 附 录 A （资料性附录） 主要仪器设备 A.1 荧光定量 PCR仪（全波长）。 A.2 台式离心机（转子容积 2 mL， 50 mL；最高离心力 15 000 g）。 A.3 电热恒温水槽（室温至 100 ）。 A.4 涡旋振荡器。 A.5
14、天平（精密度千分之一以上）。 A.6 冰箱（ 2 8 ， -20 ， -80 ）。 A.7 微量可调移液器（ 0.25 L， 10 L， 100 L， 200 L， 1 000 L）。 A.8 微量带滤芯吸头（ 10 L， 100 L， 1 000 L）。 A.9 级生物安全柜 A型。 A.10 1.5 mL Eppendorf管。 A.11 0.2 mL 8联排 PCR反应管。 A.12 一次性手套。 A.13 一次性口罩。 A.14 医用废弃物容器。 DB37/T 3625 2019 6 B B 附 录 B （规范性附录） 牛羊养殖场环境气溶胶样本的采集方法和注意事项 B.1 采样环境 环
15、境温度 5 。 B.2 试剂 0.9 %灭菌生理盐水和橄榄油。 B.3 仪器与耗材 空气微生物采样箱， Porton空气微生物采样器，三角支架，灭菌注射器（ 10 mL），一次性口罩， 一次性手套，一次性无菌隔离服。 B.4 采样人员要求 现场采样的工作人员要穿工作服和胶鞋、戴上口罩、防风眼镜和一次性乳胶手套，做好个人安全防 护。 B.5 采样工具 采集气溶胶用的气溶胶采样器、生理盐水分别包装并提前 121 高压灭菌消毒，灭菌的离心管，灭 菌的塑料袋，一次性注射器，胶布，保温箱，记号笔。使用前要仔细检查塑料管、消毒的塑料袋，有破 损者不得使用。 B.6 气溶胶样品采样 B.6.1 设备安装：首
16、先安装三脚架，空气微生物采样器放置高度为距地面 1.5 m，将 30 mL灭菌生理盐 水注入，同时滴加一滴橄榄油，放入三脚固定支架内固定。橡胶连接管的一端接到空气微生物采样箱主 机入气口上，另一端连接到 Porton空气微生物采样器的出气口上。 B.6.2 收集参数：采用液体冲击式采样方式，采样流量为 12.5 L/min，采样时间为 30 min。 B.6.3 收集标准：每个牛羊养殖场一般在产房、动物房、运动场和奶厅 4个位置分别采集 2份样本。 B.6.4 样品的灭活处理与分装：气溶胶采样器采集结束后，直接将 30 mL样本收集到采集 50 mL离心管， 采样器立即用 2 %石碳酸溶液灭活
17、处理，放入塑料袋封口。气溶胶采集液立即用 2 %石碳酸溶液灭活处理， 盖好离心管盖，胶布封口，在塑料管壁记录采样牛场、位置、采样时间、采样人，然后装入塑料袋封口， 在塑料袋上同样记录采样牛场、位置、采样时间、采样人。将装有气溶胶样本的塑料管竖直口朝上和冰 袋一块放入保温箱，盖好盖子，胶带封口。派车专程送往有条件的实验室进行布鲁氏菌荧光定量 PCR鉴 别检测，采集的两份样品，一份用于直接检测，另一份 -20 保存用于复检。 DB37/T 3625 2019 7 B.6.5 样品运送：在样品运送过程中，装样品的保温箱不得倾倒，以防液体外溢。到达目的地后，对 车体应全面消毒。 B.7 采样现场用具处
18、理 现场采集完气溶胶，立 即对空气微生物采样箱、三角支架用 1 %来苏尔溶液消毒。 DB37/T 3625 2019 8 C C 附 录 C （资料性附录） 气溶胶布鲁氏菌核酸荧光定量 PCR鉴别诊断结果图 说明： 1 8代表 1 108 1 101拷贝数 /反应的标准品的扩增曲线，曲线 9为阴性对照。 图 C.1 布鲁氏菌通用型实时定量 PCR灵敏度扩增曲线 说明： 1 3模板分别为牛种布鲁氏菌 A19株核酸、羊种布鲁氏菌 M5株核酸、猪种布鲁氏菌 S2株核酸。 4 11分别为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、溶血性链球菌、嗜肺巴氏杆菌、结核杆菌、螺旋杆菌、 绿脓杆菌的核酸。 12为阴性
19、对照。 图 C.2 布鲁氏菌通用型实时定量 PCR特异性扩增曲线 DB37/T 3625 2019 9 说明： A 1 108 1 101拷贝数 /反应的标准品的扩增曲线。 B 牛种布鲁氏菌核酸阳性的熔解曲线 Tm值为：（ 87.8 0.5） 图 C.3 牛种布鲁氏菌灵敏度扩增曲线和阳性结果熔解曲线 说明： A 1 108 1 101拷贝数 /反应的标准品的扩增曲线。 B 羊种布鲁氏菌核酸阳性的熔解曲线 Tm值为：（ 86.7 0.5）。 图 C.4 羊种布鲁氏菌核酸阳性结果熔解曲线 说明： A 1 108 1 101拷贝数 /反应的标准品的扩增曲线。 B 猪种布鲁氏菌核 酸阳性的熔解曲线 T
20、m值为：（ 84.5 0.5）。 图 C.5 猪种布鲁氏菌核酸阳性结果熔解曲线 DB37/T 3625 2019 10 说明： A 牛种、羊种和猪种布鲁氏菌分型的熔解曲线。 B SYBR Green实时定量 PCR鉴别牛、羊和猪种布鲁氏菌气溶胶样本阳性结果熔解曲线。 图 C.6 牛种、羊种和猪种布鲁氏菌鉴别检测熔解曲线结果 DB37/T 3625 2019 11 D D 附 录 D （规范性附录） 检测过程防止交叉污染的措施 D.1 样品采集与运输 D.1.1 采样采集：采集样本使用独立的气溶胶采样器和收集管。一个气溶胶采样器限于采集一份样本， 收集管使用一次性灭菌离心管。防止不同样品之间通过
21、采样器、收集管交叉污染 。 D.1.2 样本运输与贮存：防止样品在运输与贮存过程中包装损坏造成交叉污染。 D.2 检测过程 PCR反应试剂应按检测需求分装贮存，避免同一管试剂多次开启使用。装有核酸模板、 PCR试剂和引 物的离心管在打开之前，应短暂离心，所有操作尽量避免产生气溶胶。上机运行前，应检查并盖紧各 PCR 管。 D.3 人员要求 采样人员穿一次性无菌隔离服，戴一次性手套和口罩。实验室检测人员应由具备资格的工作人员操 作。 D.4 用具灭菌 气溶胶采样器清洗干净后 121高压灭菌处理 20 min。 D.5 仪器设备与耗材 使用带滤芯吸头。吸头、离心管、 PCR管等应一次性使用， 不得回收清洗后重复使用。 D.6 实验室 实验室应该设有核酸提取工作区、 PCR加样工作区以及荧光定量 PCR仪放置区，不同区域可密闭进行 紫外消毒，并配备级生物安全柜 A型。上述区域在每次使用后应及时清洁处理，并在使用前后照射紫 外 30 min以上。每个区域应有专门的废弃物容器，该容器应能耐受煮沸、 2%石碳酸溶液消毒处理。每次 实验结束，应在紫外消毒前，及时清理废弃物及消毒容器，并将该废弃物容器放回工作区进行紫外消毒。 D.7 其他 应遵循核酸检测实验室其他技术要求。 _
