1、ICS 11.220 B 41 DB37 山东省 地 方 标 准 DB 37/T 3573 2019 牛支原体诊断技术规程 Code of Practice for the Diagnosis of Mycoplasma Bovis 2019 - 05 - 29发布 2019 - 06 - 29实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 3573 2019 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语与定义 . 1 4 试剂及仪器 . 1 4.1 试剂 . 1 4.2 仪器 . 2 5 样品采集与处理 . 2 5.1 疑似牛支原体感牛只的判断 . 2
2、5.2 疑似病例样品的采集 . 2 5.3 样品处理 . 2 6 微生物学检测法 . 2 6.1 液体培养 . 2 6.2 菌落形态观察 . 2 6.3 Dienes染色 . 3 6.4 生化试验 . 3 6.5 结果判定 . 3 7 核酸检测法 . 3 7.1 DNA模板的制备 . 3 7.2 PCR检测 . 3 7.3 凝胶电泳 . 4 7.4 质量控制 . 4 7.5 结果判定 . 4 8 废弃物的处理和检测过程中安全措施 . 4 9 操作注意事项 . 5 附 录 A （规范性附录） 培养基的制备方法 . 6 DB37/T 3573 2019 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.1
3、2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。 本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛 研究中心、中国农业科学院兰州兽医研究所、威海市畜牧 兽医局。 本标准主要起草人：张亮、杨宏军、解晓莉、孙阳阳、储岳峰、赵国清、程凯慧、楚会萌、刘来兴、 杨美。 DB37/T 3573 2019 1 牛支原体诊断技术规程 1 范围 本标准规定了牛支原体诊断技术的术语和定义、试剂及仪器、样品的采集与处理方法、生化鉴定方 法、核酸检测方法和操作注意事项等。 本标准适用于牛支原体的实验室诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
4、。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 6682 2008 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14926.8 2001 实验动物 支原体检测方法 GB 15981 1995 消毒与灭菌效果的评价方法与标准 GB 19489 2008 实验室生物安全通用要求 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 牛支原体 Mycoplasma bovis 柔膜菌纲支原体目支原体科支原体属，可引起成母牛乳腺炎、犊牛肺炎和关节炎等多种疾病的病原 之一。 3.2 Dienes 染色液 一种经典的利用天青
5、美蓝染色检测支原体的染色液。 3.3 类胸膜肺炎微生物培 养基 Pleuropneumonia-Like Organisms medium， PPLO培养基 该培养基主要成分为牛心汤、酵母浸出物、牛肉膏等，不含精氨酸、酚红、葡萄糖等成分，主要用 于多种支原体的分离和培养。 4 试剂及仪器 4.1 试剂 DB37/T 3573 2019 2 去离子水（符合 GB 6682 2008的相应要求）；牛支原体检测培养基所需试剂及配制方法见附录 A； Taq DNA聚合酶及其反应缓冲液；生理盐水； Dienes染色液； TAE电泳缓冲液；琼脂糖 4.2 仪器 接种环、酒精灯、移液器（ 5 100 L和
6、100 1 000 L）、枪头（ 200 L和 1 mL）、培养试管 （ 15 mL）和玻璃平皿（ 90 mm）、 CO2恒温培养箱、移液器、 1 L容量瓶、核酸扩增仪、电泳仪、高压灭 菌锅、正置光学显微镜。 5 样品采集与处理 5.1 疑似牛支原体感牛只的判断 5.1.1 肺炎型，主要表现为咳嗽、喘，有清亮或脓性鼻液，伴随出现关节炎或角膜结膜炎；不同病死 牛只的病变差异较大，通常病牛心叶及部分膈叶的局部红色肉变，或同时有化脓灶散在分布。 5.1.2 乳腺炎型，主要表现为临床型乳腺炎和隐性乳腺炎，前者乳汁带血或呈灰色，后者体细胞数较 高，无明显临床症状，但多数情况下单纯感染无明显的红肿热痛。
7、5.1.3 关节炎型 ，主要表现为犊牛膝关节肿大、跛行，关节炎淡黄色或浓稠，常与肺炎性伴随发生。 5.2 疑似病例样品的采集 根据“ 5.1”所述牛支原体感染的三种临床表现型，分别进行样品的采集，具体要求如下： a) 肺炎型：应采集新病死牛只的肺部实变部分或病牛的鼻腔液，置专用采样器或无菌容器中； b) 乳腺炎型：采集前，应弃病牛的前三把奶，再采集病牛乳汁约 15 mL，置注射器或无菌容器中； c) 关节炎型：对采集部位进行消毒后穿刺吸取关节液约 2 mL 5 mL，置注射器或无菌容器中。 5.3 样品处理 5.3.1 组织样品的处理 剪至云雾状后，用 2 mL生理盐水重悬， 7 500g离心
8、 5 min，用注射器吸取 1 mL上清液经 0.45 m滤 膜滤过后备用。 5.3.2 鼻拭子的处理 用 2 mL生理盐水浸润拭子后， 7 500 g离心 5 min，吸取 1 mL上清液经 0.45 m滤膜滤过后备用。 5.3.3 奶样或关节液样品的处理 分别取 1 mL原液与 1 mL生理盐水充分混合， 7 500 g离心 5 min，用注射器吸取 1 mL上清液经 0.45 m滤膜滤过后备用。 6 微生物学检测法 6.1 液体培养 将 0.5 mL“ 5.3”所述处理所得上清液加入到含 4.5 mL PPLO液体培养基的试管中，置于 37 ， 5 % CO2培养箱中培养 3天，选择 P
9、PLO液体培养基由红色变为黄色且透亮的培养液用于进一步检验。 6.2 菌落形态观察 DB37/T 3573 2019 3 取 50 L疑似液体培养阳性的样品加入到 PPLO固体培养基（配方见附录 A）上，涂布均匀后，置于 37 ， 5 % CO2培养箱中培养 3 5天后， 4倍物镜下观察菌落形态。 6.3 Dienes染色 将有可疑菌落的固体培养基平皿进行 Dienes染色， 37 孵育 30 min后，观察菌落颜色。 6.4 生化试验 6.4.1 洋地黄皂苷敏感试验 将“ 6.1”中变为黄色的培养液， 1:10接种于含 0.2 mg/mL洋地黄皂苷的 PPLO液体培养中，置 于 37 ， 5
10、 % CO2培养箱中培养 3天，观察培养基颜色变化。当培养基颜色不变时，说明洋地黄皂苷敏感；当培养 基颜色变黄时，说明洋地黄皂苷不敏感。 6.4.2 葡萄糖发酵试验 葡萄糖发酵试验培养基配制方法见“附录 A”。将“ 6.1”中变为黄色的培养液， 1:10接种于葡萄糖 发酵试验培养基中，置于 37 ， 5 % CO2培养箱中培养 3天，观察培养基颜色变化。当培养基颜色不变 时，说明不发酵葡萄糖；当培养基颜色变黄时，说明发酵葡萄糖。 6.4.3 精氨酸水解试验 精氨酸水解试验培养基配制方法见“附录 A”。将“ 6.1”中变为黄色的培养液， 1:10接种于精氨酸 水解试验培养基中，置于 37 ， 5
11、 % CO2培养箱中培养 3天，观察培养基颜色变化。当培养基颜色不变 或变黄时，说明不水解精氨酸；当培养基颜色变红时，说明水解精氨酸。 6.5 结果判定 当同时满足以下条件时，判定为牛支原体阳性： a) 镜检存在圆形、中间有颗粒或隆起的煎蛋样菌落； b) Dienes染色菌落为蓝色； c) 生化鉴定结果为洋地黄敏感、不能发酵葡萄糖、不能水解精氨酸。 其他情况均视为牛支原体阴性。 7 核酸检测法 7.1 DNA模板的制备 7.1.1 水煮法 取“ 5.3”所述的上清样 1 mL于灭菌的 2 mL Eppendorf管中 ， 12 000g离心 12 min，弃上清，沉淀重 悬于 200 L无菌
12、ddH20中，沸水浴 15 min后立即冰浴 2 min，待 Eppendorf管冷却后 12 000g离心 10 min， 取上清液即为样品 DNA模板。 7.1.2 试剂盒法 提取样品 DNA模板时，采用商品化的支原体基因组 DNA提取试剂盒或革兰氏阴性菌基因组 DNA提取试 剂盒进行提取，操作步骤参照商品化试剂盒说明书。 7.2 PCR检测 DB37/T 3573 2019 4 7.2.1 PCR反应引物 参照国际上常用的 PCR诊断方法，选择针对牛支原体设计的一对特异性引物用于 PCR检测 （ Subramaniam, et al. Molecular & Cellular Probe
13、s, 1998.），目标产物大小为 1 626 bp，引物信 息如下： MBOUVRC2-L： 5 - TTACGCAAGAGAATGCTTCA -3 MBOUVRC2-R： 5 - TAGGAAAGCACCCTATTGAT -3 7.2.2 PCR反应体系 经“ 7.1”提取的样品 DNA模板，以牛支原体 DNA作为阳性对照， ddH2O为阴性对照。 PCR反应体系如 表 1。 表 1 牛支原体 PCR反应体系中各成分添加量 试剂名称 用量 Taq 酶（ 1 000 U/mL） 1 L 10反应缓冲液（含镁离子） 2 L dNTP（ 10 mM） 1 L 上游引物（ 10 M） 1 L 下游
14、引物（ 10 M） 1 L 检测模板 5 L ddH20 9 L 总体积 20 L 7.2.3 PCR反应条件 95 预变性 5 min；循环设置为 95 变性 30 s， 52 退火 30 s， 72 延伸 1.5 min，设置 36个循 环； 72 充分延伸 10 min；降温至 4 后取出产物待检。 7.3 凝胶电泳 采用 1.5 %琼脂糖凝胶，在 120 V电压下，电泳 35 min后，通过凝胶成像系 统观察样品孔是否存在大 约 1 600 bp左右的亮带。 7.4 质量控制 若阳性对照存在 1 600 bp左右的亮带，且阴性对照无此亮带，即阴阳性对照成立，可进行结果判定； 反之，则应
15、重复 PCR检测试验。 7.5 结果判定 电泳结果存在 1 600 bp左右亮带，所对应样品被判定为牛支原体阳性；其他情况均可被判定为牛支 原体阴性。 8 废弃物的处理和检测过程中安全措施 按照 GB 19489 2008中规定执行。 DB37/T 3573 2019 5 9 操作注意事项 9.1 牛支原体的分离培养与检测应在独立试验空间进行，严格进行无菌操作，以避免交叉污染。 9.2 采集样本应避免冷冻或高温，冷 藏条件下 48 h内送实验室进行检测。 9.3 支原体培养基的配置应选用去离子水。 9.4 从高度疑似样品中分离培养支原体时，如液体培养无变色，应继续盲传 2 3代。 9.5 培养
16、、 PCR和染色检测，均应设置阴性对照和阳性对照。 DB37/T 3573 2019 6 A A 附 录 A （规范性附录） 培养基的制备方法 A.1 PPLO液体培养基（ pH值为 7.6） PPLO粉 21.0 g，酵母粉 2.5 g，葡萄糖 2.5 g，丙酮酸钠 2.0 g，溶于 850 mL ddH2O中，加入 1 % (w/v) 酚红溶液 4 mL， 116 灭菌 20 min（按照 GB 15981 1995执行），加入 56 灭活的马血清 150 mL和 20 万单位青霉素，调节 pH值为 7.6，每 4.5 mL分装至 15 mL培养管，冷藏保存 1个月。 A.2 PPLO固体
17、培养基（ pH值为 7.6） PPLO粉 21.0 g，酵母粉 2.5 g，葡萄糖 2.5 g，丙酮酸钠 2.0 g，琼脂粉 20.0 g，溶于 850 mL ddH2O 中，加入 1 % (w/v) 酚红溶液 4 mL， 116 灭菌 20 min（按照 GB 15981 1995执行），冷却至 55 左 右。无菌操作加入 56 灭活的马血清 150 mL和 20万单位青霉素，调节 pH值为 7.6，每 15 mL倒入 90 mm 无菌培养皿，冷却凝固，室温保存 1周，冷藏保存 1个月。 A.3 葡萄糖发酵试验培养基 PPLO粉 2.1 g，酵母粉 0.25 g，葡萄糖 0.25 g，溶于
18、85 mL ddH2O中，加入 1 % (w/v) 酚红溶液 0.2 mL， 116 灭菌 20 min（按照 GB 15981 1995执行），加入 56 灭活的马血清 150 mL和 20万单位青霉素， 调节 pH值为 7.6，每 4.5 mL分装至 15 mL培养管，冷藏保存 1个月。 A.4 精氨酸水解试验培养基 PPLO粉 2.1 g，酵母粉 0.25 g，精氨酸 1.0 g，溶于 85 mL ddH2O中，加入 1 % (w/v) 酚红溶液 0.2 mL， 116 灭菌 20 min（按照 GB 15981 1995执行），加入 56 灭活的马血清 150 mL和 20万单位青霉素， 调节 pH值为 7.0，每 4.5 mL分装至 15 mL培养管，冷藏保存 1个月。 _
