1、ICS 65.020.01 B 40 DB37 山东省 地 方 标 准 DB 37/T 3572 2019 牛乳中 A2型 -酪蛋白（ A2奶）检测技术规 程 Code of practice for detection of A2 type of -casein (A2 milk) in cows milk 2019 - 05 - 29发布 2019 - 06 - 29实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 3572 2019 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 检测原理 . 1 5 主要试剂配制 . 2 6 主要仪器
2、设备 . 2 7 质谱检测及数据处理参数 . 2 8 检测方法 . 2 8.1 样本采集 . 2 8.2 蛋白提取 . 2 8.3 蛋白质的消化 . 2 8.4 质谱鉴定 . 3 9 结果判定 . 3 9.1 SDS-PAGE 鉴定 . 3 9.2 A2 型 -酪蛋白的判定 . 3 10 废弃物的处理 . 3 11 检测过程中防止交叉污染的措施 . 3 附 录 A （资料性附录） 主要试剂配制 . 4 附 录 B （资料性附录） 主要仪器设备 . 6 附 录 C （资料性附录） 蛋白检测参数及结果 . 8 DB37/T 3572 2019 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给
3、出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、山东奥克斯畜牧种业有限公司、山东省畜牧 总 站、大同市南郊区四方高科农牧有限公司、中国农业大学、江苏省农业学院畜牧研究所。 本标准主要起草人：黄金明、王秀革、鞠志花、姜强、王玲玲、张思聪、张亚冉、魏晓超、高亚平、 刘文浩、高运东、侯明海、杨国瑞、戴蕴平、仲跻峰。 DB37/T 3572 2019 1 牛乳中 A2型 -酪蛋白（ A2奶）检测技术规程 1 范围 本标准规定了牛奶和奶粉中 A2型 -酪蛋白（ A2奶）的检测方法。 本标准适用于牛奶和奶粉
4、中 A2型 -酪蛋白（ A2奶）的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注 日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 GB/T 19495.2 2004 转基因产品检测 实验室技术要求 GB/Z 35959 2018 液相色谱 -质谱联用分析方法通则 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 A2型 -酪蛋白 A2 -casein； A2 CSN2 -酪蛋白由 224个氨基酸（含有 15个氨基酸的信号肽）组成，具有不同的变体型
5、（ A1、 A2、 A3、 B、 C、 E、 F、 H1、 I），当第 51位、 52位、 82位、 103位、 108位、 121位、 137位、 167位氨基酸分别为谷氨 酸、谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、丝氨酸、脯氨酸时，称为 A2型 酪蛋白。 3.2 A2奶 A2 milk 所含 酪蛋白为 A2型的牛奶称为 A2奶。 3.3 质谱法 Mass spectrometry； MS 试样被电离后，形成不同质荷比的离子，根据这些离子的质量数和相对丰度分析试样的方法。 3.4 质荷比 Mass-to-charge ratio 离子的质量 m与其所带的电荷数 z之比，以 m/z表示。
6、4 检测原理 DB37/T 3572 2019 2 -酪蛋白变体型对应不同的氨基酸突变位点（ p.51 E K、 p.52 E K、 p.82 P H、 p.103 L I、 p.108 M L、 p.121 H Q、 p.137 S R、 p.167 P L）（参考序列： GenBank AAA30431.1），而不同氨 基酸之间存在分子量差异。利用质谱分析技术，根据质荷比差异将样品蛋白质中存在氨基酸突变的肽段 鉴定出来，从而确定氨基酸突变位点，实现对不同变体型 -酪蛋白检测的目的。 5 主要试剂配制 实验所用水为符合 GB/T 6682规定的双蒸水；高压灭菌条件为 121 ， 1.034
7、105 Pa压力，蒸汽灭 菌 20 min。试剂配 制见附录 A。 6 主要仪器设备 见附录 B。 7 质谱检测及数据处理参数 见附录 C。 8 检测方法 8.1 样本采集 8.1.1 待检测的新鲜牛奶 每头奶牛采集新鲜牛奶（排除头奶或末乳） 50 mL，充分混匀后， -80 保存。 8.1.2 待检测的商品化奶粉 包装未开封，常温储存。 8.2 蛋白提取 8.2.1 从 -80 取出牛奶样本，常温解冻后充分混匀，取样 50 L，或称取奶粉样本 30 mg。 8.2.2 向上述样品中加入 500 L 裂解液【 8 M 尿素， 30 mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（ HEPES）】。冰上 裂解 10
8、 min。离心， 4 ， 20 000 g， 30 min。取上清 ，避免吸到油脂。 8.2.3 加入二硫苏糖醇（ DTT）至终浓度 10 mM。 56 水浴 1 h。取出后，迅速加入碘乙酰胺（ IAM） 至终浓度 55 mM，暗室静置 1 h。 8.2.4 使用考马斯蓝染色法（ bradford 法）对蛋白质进行定量。 8.2.5 对定量后的蛋白质进行十二烷基磺酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS-PAGE）鉴定（如附录 C.1）。 8.3 蛋白质的消化 8.3.1 每个样品取 20 g 蛋白，加入到 10 K 超滤管中， 14 000 g， 4 ，离心 40 min，弃废液。 8.3.2
9、加入 200 L 的 25 mM 碳酸氢铵（ NH4HCO3）， 14 000 g， 4 ， 离心 40 min，弃废液。 8.3.3 重复上述步骤两遍。 8.3.4 加入 1 g/ L 的胰蛋白酶（ Trypsin）和 V8 蛋白酶（ Glu-C）各 1 L， 37 水浴 24 h。离 心收集消化后的肽段。 DB37/T 3572 2019 3 8.3.5 真空抽干消化后的肽段。 8.3.6 0.1 %甲酸（ FA）复溶肽段。 8.4 质谱鉴定 8.4.1 将肽段 上机检测。使用 Q-Exactive 四级杆 -静电场轨道阱质谱仪检测肽段信号，液相及质谱检 测参数详见附录 C 表 C.1、表
10、 C.2、表 C.3。 8.4.2 质谱扫描完毕，得到质谱原始文件。将质谱原始文件输入到 PD（ Proteome Discoverer 1.3, Thermo）软 件后，筛选质谱谱图。筛选参数见附录 C 表 C.4。 8.4.3 PD 提取后的谱图用 Mascot 软件进行搜索，搜索结束后， PD 软件根据 Mascot 软件搜索结果输出 鉴定结果。检索参数见附录 C 表 C.5，鉴定的肽段见附录 C 表 C.6。 9 结果判定 9.1 SDS-PAGE鉴定 将从样品中提取的蛋白质进行 SDS-PAGE分离鉴定，检测蛋白条带是否清晰无降解。条带清晰，表示 可用于后续检测，否则重新取样鉴定。见
11、 附录 C.1。 9.2 A2型 -酪蛋白的判定 根据质谱鉴定结果，当待测样品的 8个氨基酸突变位点分别为 p.51 E、 p.52 E、 p.82 P、 p.103 L、 p.108 M、 p.121 H、 p.137 S、 p.167 P时，检测结果表述为“ A2奶”（如图 1）。 注： 下划线标出的氨基酸为不同变体型 -酪蛋白中存在突变的位点，实线框内为氨基酸突变类型 图 1 A2型 -酪蛋白对应的氨基酸序列 10 废弃物的处理 按照 GB/T 19495.2 2004的规定执行。 11 检测过程中防止交叉污染的措施 按照 GB/T 19495.2 2004的规定执行。 DB37/T 3
12、572 2019 4 A A 附 录 A （资料性附录） 主要试剂配制 A.1 样品裂解液 将 480.4 g尿素， 7.1 g HEPES溶于 800 mL蒸馏水中，充分溶解 后，定容至 1 L。 A.2 10 % SDS 将 10 g的 SDS粉末溶于 80 mL蒸馏水中，充分溶解后，定容至 100 mL。 A.3 30 %丙烯酰胺 将 29 g丙烯酰胺和 1 g N,N -亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为 60 mL的蒸馏水中，充分溶解后，定容 至 100 mL。 A.4 1.5 M Tris-HCl(pH8.8) 将 181.65 g Tris溶于 800 mL蒸馏水中，加浓盐酸调 pH至
13、8.8，定容至 1 000 mL。 A.5 1 M Tris-HCl(pH=6.8) 将 121.1 g Tris溶于 800 mL蒸馏水中，加浓盐酸调 pH至 6.8，定容至 1 000 mL。 A.6 10 %过硫酸铵 将 10 g过硫酸铵粉末溶于 80 mL蒸馏水中，充分溶解后，定容至 100 mL。 A.7 考马斯亮蓝染色液 准确量取甲醇 45 mL，蒸馏水 45 mL，冰乙酸 10 mL，加入 0.25 g考马斯亮蓝 R-250。 A.8 考染脱色液 50 mM碳酸氢铵 /乙腈 =1:1。 A.9 1 g/ L胰蛋白酶 将 100 g胰蛋白酶溶解到 100 L 50 mM乙酸中， -
14、70 储存。 DB37/T 3572 2019 5 A.10 25 mM碳酸氢铵 将 2.0 g碳酸氢铵溶于 800 mL蒸馏水中，充分溶解后，定容至 1 L。 DB37/T 3572 2019 6 B B 附 录 B （资料性附录） 主要仪器设备 B.1 单道可调移液器 2 L， 10 L， 20 L， 100 L， 200 L， 1 000 L。 B.2 离心机 最高转速 12 000 r/min，最大容量 24 1.5 mL。 B.3 电子天平 量程 0.001 100 g，感量 0.001 g。 B.4 凝胶成像分析系统 有效像素 1280 1024，检测灵敏度 DNA 0.05 ng
15、。 B.5 稳压稳流电泳仪 输出电压 0 600 V，输出电流 0 100 mA。 B.6 垂直电泳槽 外形尺寸 15 cm 12 cm 13 cm，凝胶板面积 10 cm 10 cm。 B.7 高压灭菌锅 使用温度范围 45 135 ，最高使用压力 0.255 Mpa。 B.8 自动双重纯水蒸馏器 功率 3 000 W，出水量 2 500 mL/h。 B.9 微波炉 功率 700 W，容积 20 L，尺寸 262 mm 452 mm 365 mm。 B.10 冰箱 DB37/T 3572 2019 7 4 ， -20 。 B.11 电热恒温水浴锅 RT+5 70 。 DB37/T 3572
16、2019 8 C C 附 录 C （资料性附录） 蛋白检测参数及结果 C.1 SDS-PAGE鉴定结果 图 C.1 SDS-PAGE检测结果（实线框内条带为 -酪蛋白） C.2 质谱检测主要仪器参数 质谱仪： Thermo Q-Exactive 纳升液相： Dionex ultimate 3000 nano LC system 表 C.1 质谱检测 -纳升液相色谱柱及流动相 项目 参数 NanoLC trap Acclaim PePmap 100 150 m2 cm nanoviper C18 5 m 100 NanoLC column C18 5 m 75 m15 cm 孔径 300 Sol
17、vent A 0.1% formic acid 2% ACN 98% water Solvent B Flowrate 0.1% formic acid 2%water 98% ACN 0.4 L/min DB37/T 3572 2019 9 表 C.2 质谱检测 -NanoLC液相梯度 时间（分） B 液比例 0 10 40 45 48 55 58 65 65.01 5 % 5 % 30 % 60 % 80 % 80 % 5 % 5 % STOP 表 C.3 质谱检测 -Q-E质谱仪参数 参数名称 参数值 离子模式 (Polarity) 正离子模式 母离子扫描范围 (MS Scan rang
18、e) 350-2 000 m/z 二级分辨率 (Resolution) 17 500 毛细管温度 (Capillary temperature) 320 度 离子源电压 (Ion source voltage) 碎裂模式 (MS/MS acquisition modes) 1 800 V Higher collision energy dissociation（ HCD） 碰撞能量归一化 (normalized collision energy (NCE) 28 C.3 质谱数据处理参数 表 C.4 谱图筛选参数 参数名称 实验选项 母离子质量范围 350-6 000 Da 二级质谱图中最小峰
19、数 10 信噪比 S/N 域值 1.5 DB37/T 3572 2019 10 表 C.5 鉴定检索参数 参数名称 Parameter 实验选项 Mascot 版本号 (Mascot Version) 2.3.0 固定修饰 (Fixed modification) Carbamidomethyl(C) 可变修饰 (Variable modification) Oxidation(M) ， GlnPyro -Glu(N-term Q) Phospho(ST)， SerArg(S) ， SerLys(S) ， Arg Cys(R)， GlnGlu(Q) ， GluLys(E) ， MetLeu(M
20、) ， ProHis(P) ， ProLeu(P) ， HisGln(H) 一级质量偏差 (peptide tol.) 15 ppm 二级质量偏差 (MS/MS tol) 最大允许漏切数 (Max missed cleavages) 20 mmu 1 酶的类型 (Enzyme) Trypsin 数据库 (Database) Uniprot_Bos taurus (序列数： 32205) C.4 蛋白肽段质谱图 以检测到的肽段 VMGVSKVKE（ 107位 -115位）为例，肽段中 N端碎片离子为 b离子模式， C端碎片离子 为 y离子模式， b2代表肽段中 N端前两个氨基酸组成的碎片离子，
21、上、下质谱图（图 C.2）中 b2分子量 差值 18也是甲硫氨酸（ 149.2）和亮氨酸 (131.2)的分子量差值，因此根 据二级质谱图分析，上图为含氨基酸 突变（ p.108 M L）的肽段。其它肽段质谱图略。 DB37/T 3572 2019 11 图 C.2 蛋白肽段质谱图 C.5 肽段鉴定结果 表 C.6 靶标蛋白肽段鉴定列表（其中小写字母代表修饰 /突变位点） 肽段序列 修饰 /突变 FQsEEQQQTEDELQDK S3(Phospho) FQSEEQQQTEDELQDK DMPIQAFLLYQEPVLGPVR FQsEEQqQTEDELQDK S3(Phospho); Q7(G
22、ln-Glu) KIEKFqsEEQQqtEDELQDK Q6(Gln-Glu); S7(Phospho); Q12(Gln-Glu); T13(Phospho) DMPIqAFLLYQEPVLGPVR Q5(Gln-Glu) FqsEEqQqtEDELQDK Q2(Gln-Glu); S3(Ser-Arg); Q6(Gln-Glu); Q8(Gln-Glu); T9(Phospho) IEKFQsEEQQQTEDELQDK S6(Phospho) DB37/T 3572 2019 12 表 C.6 靶标蛋白肽段鉴定列表（其中小写字母代表修饰 /突变位点） （续） 肽段序列 修饰 /突变 IE
23、KFqsEEQqQtEDELQDK Q5(Gln-Glu); S6(Phospho); Q10(Gln-Glu); T12(Phospho) VLPVPQKAVPYPQR DMPIqAFLLYqEPVLGPVR Q5(Gln-Glu); Q11(Gln-Glu) DMPIQAFLLYQEPVLGPVRGPFPIIV IHPFAqTqsLVYPFPGPIPNSLPQNIPPLTQTPVVVPPFLqPEVMGVSK Q6(Gln-Glu); Q8(Gln-Glu); S9(Ser-Lys); Q41(Gln-Glu) IHPFAQTQSLVYPFPGPIPNsLPqNIPPLTQTPVVVPPF
24、LQPEVMGVsK S21(Ser-Arg); Q24(Gln-Glu); S48(Ser-Arg) IHPFAQTQSLVYPFPGPIPNSLPQNIPPLTQTPVVVPPFLQPEVmGVSK M45(Met-Leu) HKEMPFPK IEKFqsEeqqQTEDELQDK Q5(Gln-Glu); S6(Phospho); E8(Glu-Lys); Q9(Gln-Glu); Q10(Gln-Glu) IHPFAqTQSLVYPFPGPIPNSLPqNIPPLTqTPVVVPPFLQPEVMGVSK Q6(Gln-Glu); Q24(Gln-Glu); Q31(Gln-Glu) IEKFqsEEqqqtEDELQDK Q5(Gln-Glu); S6(Phospho); Q9(Gln-Glu); Q10(Gln-Glu); Q11(Gln-Glu); T12(Phospho) IEKFqseEqQQTEDELQDK Q5(Gln-Glu); S6(Phospho); E7(Glu-Lys); Q9(Gln-Glu) FQSeEqqqtEDELQDK E4(Glu-Lys); Q6(Gln-Glu); Q7(Gln-Glu); Q8(Gln-Glu); T9(Phospho) VmGVSKVKE M2(Met-Leu) _
