1、ICS 65.020.01 B 40 DB37 山东省 地 方 标 准 DB 37/T 3570 2019 奶牛 A2型 -酪蛋白基因检测技术规程 Code of practice for detection of A2 type of -casein gene in dairy cattle 2019 - 05 - 29发布 2019 - 06 - 29实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 3570 2019 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 检测原理 . 2 5 主要试剂 . 2 6 主要仪器设备 . 2 7 检
2、测方法 . 2 7.1 样本采集 . 2 7.2 DNA 提取 . 2 7.3 多重 PCR 扩增 . 2 7.4 多重连接酶检测反应 . 3 7.5 变体 型分析 . 3 8 结果判定 . 3 8.1 多重 PCR 扩增产物的检测 . 3 8.2 A2 型 -酪蛋白结果判定 . 4 9 废弃物的处理 . 4 10 检测过程中防止交叉污染的措施 . 5 附 录 A （资料性附录） 主要试剂配制 . 6 附 录 B （资料性附录） 主要仪器设备 . 7 附 录 C （规范性附录） 多重连接酶检测反应探针引物 . 8 DB37/T 3570 2019 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2
3、009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、山东省畜牧总站、山东奥克斯畜牧种业有限公 司、大同市南郊区四方高科农 牧有限公司、中国农业大学、江苏省农业科学院畜牧研究所。 本标准主要起草人：黄金明、王秀革、鞠志花、姜强、王玲玲、张思聪、张亚冉、高亚平、魏晓超、 刘文浩、高运东、侯明海、曲绪仙、段志伟、戴蕴平、仲跻峰。 DB37/T 3570 2019 1 奶牛 A2型 -酪蛋白基因检测技术规程 1 范围 本标准规定了奶牛 A2型 -酪蛋白基因检测的技术方法。 本标准适用于奶牛 A2型
4、-酪蛋白基因的检测与分型。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单 ）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19495.2 2004 转基因产品检测 实验室技术要求 GB/T 27642 2011 牛个体及亲子鉴定微卫星 DNA法 DB37/T 2037 2012 牛白细胞黏附缺陷症（ BLAD）基因分子检测技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 A2型 -酪蛋白 A2 -casein， A2 CSN2 Be
5、ta酪蛋白（ -酪蛋白）含有多种蛋白变体型（ A1、 A2、 A3、 B、 C、 E、 F、 H1、 I）。 酪蛋白不 同变体型之间的区别就 在于 酪蛋白基因（ CSN2）编码区一个或几个碱基的变化，导致相应氨基酸的改 变。当 CSN2基因编码区上的 8个 SNP位点 c.151 G A、 c.154 G A、 c.245 C A、 c.307 C A、 c.322 A C、 c.363 C A、 c.411 C G、 c.500 C T，基因型分别为 c.151（ GG）、 c.154（ GG）、 c.245（ CC）、 c.307（ CC）、 c.322（ AA）、 c.363（ CC）、
6、 c.411（ CC）和 c.500（ CC）时，称为 A2型 酪蛋白。 3.2 A2奶牛 A2 Cow 拥有 A2型 酪蛋白基因的奶牛，简称为 A2奶牛。 3.3 多重 PCR multiplex PCR 又称多重引物 PCR或复合 PCR，是指在同一 PCR反应体系中加上两对或两对以上引物，同时扩增出多 个对应的目标核酸片段的 PCR反应。 3.4 多重连接酶检测反应 multiplex ligase detection reaction， MLDR DB37/T 3570 2019 2 是一种利用高温连接酶实现对基因多态性位点识别的高特异性基因检测技术。 4 检测原理 基于奶牛 -酪蛋白
7、基因序列（参考序列： ENSBTAT00000003409），结合 -酪蛋白不同变体型（ A1， A2， A3， B， C， E， F， H1， I）对应的 8个 SNP位点（ c.151 G A、 c.154 G A、 c.245 C A、 c.307 C A、 c.322 A C、 c.363 C A、 c.411 C G、 c.500 C T），设计两对特异性引物（ Primer mix）进 行多重 PCR扩增出 8个 SNP位点所在的目的 DNA片段；再对每个 SNP位点设计三条探针引物（ Probe mix）， 其中在 SNP位点一侧设计两条特异性检测探针（每条探针的 3端与突变位点
8、的一种基因型互补），在另 一侧设计一条与模板完全匹配的荧光标记探针；然后在连 接酶的作用下，以扩增的多重 PCR产物为模板， 当两侧的探针与目的 DNA序列完全互补时连接反应才能进行；最后通过 ABI 3730XL测序仪，扫描连接反 应所产生的片段长度，实现对不同 SNP位点的检测。 5 主要试剂 除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合 GB/T 6682规定的双蒸水；高压灭菌条件为 121 ， 1.034 105 Pa压力，蒸汽灭菌 20 min。试剂见附录 A。 6 主要仪器设备 见附录 B。 7 检测方法 7.1 样本采集 颈静脉采集血样 3 mL 5 mL， ACD抗凝， -20 保
9、存。对公牛，亦可采集 2 3剂细管 精液（ 0.25 mL 或者 0.5 mL规格），液氮保存。 0.1 g 0.3 g组织（耳组织、肌肉）或带毛囊的牛毛浸入 75 %的酒精， -20 保存备用。 7.2 DNA提取 7.2.1 血液 DNA的提取 血液 DNA提取按 DB37/T 2037 2012中 7.2.1规定的方法执行。 7.2.2 精液 DNA提取 精液 DNA提取按 DB37/T 2037 2012中 7.2.2规定的方法执行。 7.2.3 组织和带毛囊的牛毛 DNA提取 组织和带毛囊的牛毛 DNA的提取按 GB/T 27642 2011中附录 B规定的方法执行。 7.3 多重
10、PCR扩增 7.3.1 多重 PCR扩增引物设计 DB37/T 3570 2019 3 根据 Ensembl数据库中 -酪蛋白基因序列（参考序列： ENSBTAT00000003409），并结合 -酪蛋白 不同变体型对应的 SNP突变序列信息（ c.151 G A、 c.154 G A、 c.245 C A、 c.307 C A、 c.322 A C、 c.363 C A、 c.411 C G、 c.500 C T），设计两对多重 PCR扩增引物 CNS2-MP1（ F： 5 -GGAATCTATTACACGCATCAA-3； R： 5 -TTGCACTGACATTTATATTACCA-3，扩
11、增长度 274 bp)和 CNS2-MP2 （ F： 5 -GCCCAGACACAGTCTCTAGTC-3； R： 5 -TGAATGGGCATATCTCTCTG-3，扩增长度 419 bp）扩增 SNP位点所在片段。 7.3.2 多重 PCR扩增反应体系 20 L的反应体系，包括 1 L DNA（ 50 ng/L）、 2 L Primer mix（引物 CNS2-MP1和 CNS2-MP2各 0.5 pM）、 2 L dNTP（ 2 mM/each）、 0.2 L Taq酶（ 1U）、 0.6 L Mg2+（ 3 mM）、 2 L Buffer（ 1 ）、 12.2 L ddH2O。 7.3
12、.3 多重 PCR反应条件 95 2 min。 94 30 s， 59 90 s， 65 1 min， 40个循环。 65 10 min。 7.4 多重连接酶检测反应 7.4.1 多重连接酶检测反应探针引物设计 针对每个 SNP位点（ c.151 G A、 c.154 G A、 c.245 C A、 c.307 C A、 c.322 A C、 c.363 C A、 c.411 C G、 c.500 C T）设计 3条引物，包括在 SNP位点一侧设计 2条特异性检测探针（每条探针 的 3端与突变位点的一种基因型互补），在 SNP的另一侧设计一条 与模板完全匹配的荧光标记探针，探 针序列的 5端碱
13、基磷酸化（ P），且 3端带有 6-羧基荧光素（ FAM）报告基团，所述荧光标记探针引物 的序列如附录 C所示。 7.4.2 多重连接酶检测反应体系 1 L Buffer（ 1）、 1 L Probe mix（ each）（ 2 pmol/L）、 0.05 L Taq DNA ligase（ 2 U）、 4 L ddH2O、 4 L多重 PCR产物。 7.4.3 多重连接酶检测反应条件 95 2 min。 94 15 s， 50 25 s， 40个循环。 7.5 变体型分析 检测反应完成后，通过 ABI 3730XL测序仪，扫描连接反应所产生的片段长度，应用 Genemapper软件 分析 8
14、个 SNP位点的基因型，经单倍型分析，确定 -酪蛋白的不同变体型。 8 结果判定 8.1 多重 PCR扩增产物的检测 利用 3 %琼脂糖凝胶电泳对多重 PCR扩增产物进行检测，可以看到清晰的两条带 419 bp和 274 bp（见 图 1），表明多重 PCR产物质量合格，可以应用于多重连接酶检测反应。 DB37/T 3570 2019 4 注： 1-9泳道对应样品 1-9 图 1 多重 PCR扩增产物的 3%琼脂糖凝胶电泳图 8.2 A2型 -酪蛋白结果判定 通过 ABI 3730XL测序仪扫描多重连接酶反应产物 ，根据 Genemapper软件输出峰图以及不同 SNP位点 组合对应的变体型，
15、统计 -酪蛋白的不同变体型。当奶牛 CSN2基因的 8个 SNP位点对应的基因型分别为 c.151（ GG）、 c.154（ GG）、 c.245（ CC）、 c.307（ CC）、 c.322（ AA）、 c.363（ CC）、 c.411（ CC） 和 c.500（ CC）时，检测的个体称为 A2奶牛（图 2）。 图 2 A2型 -酪蛋白 SNP位点基因分型结果 9 废弃物的处理 DB37/T 3570 2019 5 按照 GB/T 19495.2的规定执行。 10 检测过程中防止交叉污染的措施 按照 GB/T 19495.2的规定执行。 DB37/T 3570 2019 6 A A 附
16、录 A （资料性附录） 主要试剂配制 A.1 dNTP（ 2 mM/each） A.2 Taq酶（ 1 U） A.3 Mg2+（ 3 mM） A.4 PCR Buffer（ 1） A.5 DNA ligase Buffer（ 1） A.6 Taq DNA ligase（ 2 U） A.7 75 %酒精 A.8 ACD抗凝剂 柠檬酸 0.48 g、柠檬酸钠 1.32 g、葡萄糖 1.47 g，定容于 100 mL水中，高压灭菌。 A.9 10 mg/mL溴化乙锭 在 10 mL水中加入 100 mg的溴化乙锭（ EB），溶解后 分装成 1 mL小份， 4 保存。 A.10 50 TAE缓冲液 T
17、ris-base 242 g，冰乙酸 57.1 mL， 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0)100 mL，加水定容至 1 000 mL。 A.11 3 %的琼脂糖 3 g琼脂糖充分溶解于 1 TAE，定容至 100 mL。 A.12 琼脂糖电泳上样缓冲液 0.25 %溴酚兰； 0.25 %二甲苯菁 FF； 40 %的蔗糖水溶液。 DB37/T 3570 2019 7 B B 附 录 B （资料性附录） 主要仪器设备 B.1 单道可调移液器 2 L， 10 L， 20 L， 100 L， 200 L， 1 000 L。 B.2 PCR扩 增仪 温度范围 4 99 ,温度梯度范围 20
18、，模块单元 96 0.2 mL。 B.3 离心机 最高转速 12 000 r/min，最大容量 24 1.5 mL。 B.4 电子天平 量程 0.001 100 g，感量 0.001 g。 B.5 凝胶成像分析系统 有效像素 1280 1024，检测灵敏度 DNA 0.05 ng。 B.6 稳压稳流电泳仪 输出电压 0 600 V，输出电流 0 100 mA。 B.7 水平电泳槽 外形尺寸 182 mm 85 mm 5 mm，凝胶板面积 60 mm 60 mm。 B.8 高压灭菌锅 使用温度范围 45 135 ，最高使用压力 0.255 Mpa。 B.9 测序仪 ABI3730 xl（全自动
19、96道）基因测序仪， 100次（ 9 600个样品）运行试剂一次上机，自动碱基识别 与质量评分判定。 DB37/T 3570 2019 8 C C 附 录 C （规范性附录） 多重连接酶检测反应探针引物 引物序列 (5 -3) 扩增长度（ bp） 检测 SNP 位点 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAAAATTGAGAAGTTTCAGAGTG 97 c.151 G A TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAAAATTGAGAAGTTTCAGAGTA 99 P-AGGAACAGCAGCAAACAGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
20、TT-FAM TTTTTTTTTTTTTTTTATTACCTCTGTTTGCTGCTGTTT 77 c.154 G A TTTTTTTTTTTTTTTTTTATTACCTCTGTTTGCTGCTGTTC 79 P-CTCACTCTGAAACTTCTCAATTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATGTTTTGTGGGAGGCTGTTAT 105 c.245 C A TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATGTTTTGTGGGAGGCTGTTAG 107 P-GGATGGGTCCAGGGAAGGGA
21、TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACTCCCATTACTTCAGGCTGAAT 85 c.307 C A TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACTCCCATTACTTCAGGCTGAAG 87 P-GAAAGGCGGCACCACCACAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM TTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTTCACTTTGGAGACTCCCAT 81 c.322 A C TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTTCACTTTGGAGACTCCCAG 83 P-TACT
22、TCAGGCTGAAGGAAAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGGAGGCTATGGCTCCTAAGCAC 89 c.363 C A TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGGAGGCTATGGCTCCTAAGCAA 91 P-AAAGAAATGCCCTTCCCTAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCATCAGTGAGAGTCAGGCTCTGG 93 c.411 C G TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCATCAGTGAGAGTCAGGCTCTGC 95 P-CTTTCAGTAAAGGGCTCAACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGGAGGAAACATGACAGTTGGAA 101 c.500 C T TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGGAGGAAACATGACAGTTGGAG 103 P-GAAGAGGCTGGTGAGGCTGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM _
