1、ICS 65.020 B16 DB37 山东省地方标 准 DB 37/T 34792018 苹果苗木传带病虫害检测与防控技术规范 Technical specification for detection and control of nursery apple tree-transmitted pests 2018-12-29发布 2019-01-29实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 3479 2018 I 前言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由山东省农业农村厅提出并监督实施。 本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：青岛农业大学
2、。 本标准主要起草人：李保华、王彩霞、董向丽、张振芳、练森、原永兵、刘成连、周涛、曹洪建、 任洪春。 DB37/T 3479 2018 1 苹果苗木传带病虫害检测与防控技术规范 1范围 本标准规范了苹果苗本传带病虫害检测与防控的术语和定义，育苗环境、土地和育苗材料的选用标 准，及病毒检测、病虫害防控和苗传病虫害检测的技术。 本标准适用于山东省苹果苗木繁育期间，随苗木传带病虫害的防控。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 2281 苹果病毒检
3、测技术规范 3 术语和定义 规范性引用文件确立的以及下列术语和定义适用于本标准。 3.1 苗传病虫害(Seedling Transmitted Pests) 随苹果苗木传播，定殖后难彻底铲除，且危害严重的各种病虫害，主要包括病毒、类病毒、腐烂病、 轮纹病、苹果绵蚜、根癌病等。 3.2 病毒与类病毒（Apple Virus and Viroid） 造成树体生长发育不良和严重危害的病毒与类病毒，包括锈果类病毒(ASSVd)、坏死花叶病毒 (ApNMV)、凹果类病毒(ADFVd)、褪绿叶斑病毒(ACLSV)、茎沟病毒(ASGV)和茎痘病毒(ASPV)六种。 3.3 非潜隐病毒（Non-Latent
4、Virus） 在常规栽培品种上，能造成明显症状和严重危害的病毒或类病毒，主要为锈果类病毒(ASSVd)、坏 死花叶病毒(ApNMV)和凹果类病毒(ADFVd)三种。 3.4 潜隐病毒（Latent Virus） 在常规栽培品种上，不造成明显的症状，但能导致树体生长发育不良的病毒，主要为褪绿叶斑病毒 (ACLSV)、茎沟病毒(ASGV)和茎痘病毒(ASPV)三种。 DB37/T 3479 2018 2 3.5 无病毒材料（Virus-Free Material） 没有携带可检测病毒或类病毒，或经过2年3年连续检测，现代检测技术没有检测到病毒或类病毒 的繁殖材料或苗木。 3.6 非脱毒材料（Non
5、 Virus-Free Material） 指没有经过脱毒处理，不潜带有非潜隐病毒，但带有不超过一种潜隐病毒的繁殖材料或苗木。 3.7 外源病虫害（External Source Pests） 从育苗圃或采穗圃外随气流、雨水、昆虫传入，或主动迁入，并在苗木上侵染定殖的各种病虫害。 3.8 本源病虫害（Local Source Pests） 育苗圃或采穗圃内原来就有，或随苗木、接穗、气流、雨水、昆虫传入、或主动迁入，且已在苗圃 或采穗圃内定殖的病虫害。 4 苗圃地选择 选择没有交叉感染病虫害或病虫害交叉感染率低的环境，没有病菌或病菌少的地块培育苹果苗木， 保持育苗圃清洁卫生。 4.1 苗圃位置与
6、地块 宜在没有苹果种植的地区培育苹果苗木。 在苹果种植区培育苹果苗木时， 育苗圃应离苹果和梨园5km 以上，且近5年没有栽植林木及苗木。 4.2 育苗圃 宜选择开阔通风、灌溉与排水条件良好、土壤肥沃地块作育苗地。周围5km范围内不能有桧柏等刺 柏科植物。及时销毁废弃的苗木、接穗、病虫栽体、病残体等，始终保持育苗圃清洁卫生。 5 育苗材料 扩繁之前检测或检查所有繁育材料，发现带有苗木传带病虫害的材料，及时清除。 5.1 种子 从健康、无毒的母本树上采集。采种前对采种母本树进行病毒检测，发现带毒母株及时清除。 5.2 采穗圃 原种和一级母本树应每年检测一次， 非脱毒材料每2年3年检测一次， 及时清
7、除不符合标准的材料。 DB37/T 3479 2018 3 5.3 材料获取 从果园或苗圃内选择性状优良、长势良好、健壮无病的植株进行病毒检测，从中筛选无毒材料或非 脱毒材料；或筛选含容易脱除病毒的植株，进行脱毒处理，获得无毒材料或非脱毒材料。 6 病毒检测样品 6.1 采样时期 4月5月份，苹果萌芽至新梢生长期是采集病毒检测样品的最佳时期。 6.2 单株样品采集 单株样品检测主要用于筛选无毒或非脱毒材料。生长期从旺盛生长的新梢顶端摘取2 cm3 cm的嫩 芽或嫩梢，每株3个4个。休眠期剪取20 cm30 cm长的枝条，每株1个2个，或直接剥取0.5 cm长的 皮层5块6块。以株为单位将样品密
8、封于塑料袋内，标记株号、品种、采集时间、地点、采集人等信息。 6.3 混合样品采集 混合样品检测主要掌握苗木的带毒情况。以品种、行、畦、地块等为取样单元，随机取样，取样比 例不小于1 %，生长季节每株摘取1个2 cm3 cm长的嫩芽，休眠季节每株剪取1个20 cm30 cm的枝条， 以取样单元为单位密封于塑料袋中，标记取样单元、取样时间、地点、采集人等信息。 6.4 保存与运输 用0 4 的冷藏箱短期保存(2周内)；长期保存时，需先将样品用液氮速冻后，放于负80 的 低温冰箱内。嫩梢和嫩芽装入保温箱内，加冰块密封后运输；枝条可密封于塑袋中保湿运输。 6.5 检测顺序 6.5.1 筛选无毒材料时
9、，依据估测带毒普遍率，由高到低检测，或先检测潜隐病毒，淘汰带毒材料后， 再检测非潜隐病毒，逐步筛选出无毒材料。 6.5.2 筛选非脱毒材料时，首先检测非潜隐病毒，淘汰带毒材料后，再检测非潜隐病毒。 6.6 检测策略与方法 检测单株样品时，可将多个样品混合检测，发现样品带毒时，再逐个检测，最终找出带病毒植株。 检测混合样品时，可分成多个样品检测。RT-PCR检测技术按附录A的方法进行，免疫学检测和生物学检 测按NY/T 2281的规定进行。 7 病虫害防控 苹果苗木繁育期，重点防控腐烂病、轮纹病、苹果绵蚜和根部病害。 7.1 剪口处理 采穗圃和苗圃内所有剪口，在形成当天都要涂布伤口愈合剂。无伤口
10、愈合剂时，用无毒、无害、环 保的油漆作为基质，混入有效成份为0.3 %0.5 %的多菌灵或甲基硫菌灵后涂布剪口。 7.2 嫁接后处理 DB37/T 3479 2018 4 冬春季室内嫁接的苗木，嫁接后立即喷淋有效成份含量为0.03 %0.05 %的吡唑醚菌酯或0.3 % 0.5 %甲基硫菌灵药液。 7.3 根部处理 苗木栽植前，用根部处理剂或1 %的硫酸铜溶液等对细菌高效的杀菌剂浸泡根部5 min10 min后， 立即栽植。 7.4 本源病虫害 采穗圃和多年生苗圃，于3月份萌芽前，清除苗圃内及周边落叶、残余苗木、废弃物、病虫载体等， 喷35波美度的石硫合剂、1 %2 %多量式波尔多液或95 %
11、机油乳剂80倍100倍药液等。生长季节， 经常检查采穗圃和苗圃，发现腐烂病、轮纹病、白绢病、花叶病、苹果绵蚜等病虫株，及时清除，并带 离苗圃焚烧或深埋。整个生长季节，依病虫发生和降雨情况，及时喷药防控各种病虫害。 7.5 外源病虫害 周边5km范围有果园的苗圃，重点防控绵蚜、轮纹病和腐烂病，兼治苹果黄蚜、金纹细蛾、各种螨 类、褐斑病、白粉病、锈病、炭疽叶枯病等。 7.5.1 苹果绵蚜 于5月、6月份和9月、10月份绵蚜迁飞期，用诱虫板监测迁飞成虫，发现有绵蚜迁入时，及时喷撒 杀虫剂。若绵蚜已在苗圃内定殖，用药剂灌根或树上喷药彻底铲除。 7.5.2 轮纹病和腐烂病 雨水少的季节或年份，结合其他病
12、害防治喷施杀菌剂；遇雨量大于10 mm，持续时间长于24 h的阴 雨，雨后及时喷施内吸性杀菌剂。多雨季节或连续阴雨期，每7 d10 d喷施一次杀菌剂，内吸性杀菌 剂和保护性杀菌剂交替使用。 8 出圃苗木检测与处理 8.1 苗木分检与处理 起苗后剔除染有病虫和生长不良的苗木，用苗木处理剂处理苗木，或用有效成份为0.03 %0.05 % 吡唑醚菌酯或0.3 %0.5 %甲基硫菌灵药液，混加0.05 %0.1 %吡虫啉或0.3 %0.5 %毒死蜱，喷淋 整株苗木，直到根部有药液流下为止，并保湿24 h48 h。 8.2 苗木质量检测 随机选取20株50株苗木，每3株5株一组栽植于直径40 cm50
13、cm、深度40 cm50 cm的花盆中， 浇足水后，移入温度为20 30 的光照环境中培养，后期不再浇水。苗木萌芽后检查苗木发芽率、 带毒率和病虫害发生率，发现腐烂病斑、干腐病斑、苹果绵蚜等，应对苗木进行病虫害处理或销毁，对 苗木带毒率高或发芽率低的苗木，应彻底销毁。 DB37/T 3479 2018 5 AA 附录A （资料性附录） 反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测 A.1 原理 RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。利用反转录酶将病 毒或类病毒RNA反转录为 cDNA，再以cDNA为模板，经过模板变性、引物退火和引物延伸的多个循环
14、来扩 增DNA序列。这是一个指数增长的过程，上一轮的扩增产物又可作为下一轮扩增的模板，使其成为检测 核酸的一种非常灵敏的技术。 一般经过3040个循环得到的扩增产物就足够在溴化乙锭等核酸染料染色 的凝胶上观察到特异性条带。 A.2 试剂 A.2.1 Trizol试剂：由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，苯酚饱和液（38 %） -380 ml/L，硫氰酸胍盐（0.8 M）-118.16 g /L，硫氰酸铵（0.4 M）-76.12 g/L，醋酸钠（0.1 M， pH 5）- 33.4 ml/L，甘油50 ml，加水补充至1 L。 A.2.2 无RNA 酶灭菌水：将试剂瓶等容器
15、在180 烘烤6 h，去离子水中按0.01 %（体积/体积）加入D EPC（焦磷酸二乙酯） ，处理过夜后高压灭菌而得到。 A.2.3 75 %乙醇：用无RNA酶灭菌水和无水乙醇配置。 A.2.4 氯仿，异戊醇，异丙醇、无水乙醇，反转录酶，DNA聚合酶，DNA分子量标准，琼脂糖。 A.3 仪器设备 2.5l1000l各种型号移液器，高速冷冻离心机，低温冰箱，液氮罐，各种型号无RNA酶0.2ml 1.5 ml离心管和10 l1000 l枪头，PCR扩增仪，紫外分光光度计，凝胶成像体系，电泳槽和电泳仪。 A.4 操作步骤 A.4.1 总RNA的提取 A.4.1.1 按照Trizol法提取总RNA，如
16、果用商品化植物总RNA提取试剂盒提取总RNA，按试剂盒说明书进 行。 A.4.1.2 50 mg100 mg苹果组织置于1.5 ml离心管中，用液氮研磨成粉末，加入1 ml Trizol试剂， 注意样品总体积不能超过所用Trizol 体积的10 %； A.4.1.3 研磨液室温放置5 min，然后每1 ml Trizol加入0.2 ml氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离 心管15 s，4 下，12000 r/min离心10 min； A.4.1.4 取上层水相于一新的离心管，加入等体积异丙醇，室温放置10 min，12000 r/min离心10 mi n； A.4.1.5 弃去上清液，加入1 m
17、l的70 %乙醇，涡旋混匀，7500 r/min 离心5 min； DB37/T 3479 2018 6 A.4.1.6 小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5 min10 min，注意不要干燥过分，否则会降低RNA 的溶解度。 A.4.1.7 将RNA溶于DEPC处理过的无菌水中，可55 60 水浴10 min，增加RNA的溶解度。RNA可进 行mRNA分离，或贮存于70 %乙醇并保存于负70 的冰箱内。 A.4.2 核酸检测 利用紫外分光光度计检测提取的总RNA样品纯度和浓度。一般OD 260 /OD 280 1.8时，样品纯度符合要求， 计算其浓度由下面公式计算。1OD 260 40 g/
18、ml RNA，RNA（g/ml）=测得OD值40。 A.4.3 cDNA合成 以5 g总RNA为模板，以六碱基随机引物为引物，参照M-MLV反转录酶产品说明书反转录成cDNA。 一般为20 l的反转录体系：10 mol/l随机引物1.0 l，1 0 mmol/l的dNTPs 1.0 l，RNA酶抑制剂 0.5 l， 200 U/l M-MLV酶0.5 l， DEPC处理无菌水补足至20 l。 于42 反应1 h， 95 灭活3min， -20 保存备用。 A.4.4 PCR扩增 检测所用引物见表A.1，PCR反应体系为25 l：反转录产物cDNA 1.0 l，10Buffer 2.5 l， 1
19、0mmol/l 的dNTPs0.5 l，20 mol/l正向引物和20 mol/l反向引物各0.5 l，5 U/l的TaqDN A 聚合酶0.25 l，加灭菌双蒸水至25 l。PCR反应条件为：95 预变性3 min；95 变性30 s，对应 引物退火温度（表A.1）复性30 s，72 延伸30 s，35个循环；最后72 延伸5 min。 表 A.1 用于苹果病毒或类病毒 RT-PCR 检测的引物 病毒名称 序列（53） 目标片段/bp 退火温度/ 苹果褪绿叶斑病毒 (ACLSV) F: GAGARTTTCAGTTTGCTMGA R: AGTCTACAGGCTATTTATTATAAGT 794
20、 53 苹果茎沟病毒 (ASGV) F: GGAATTTCACACGACTCCTAACCCTCC R: CCCGCTGTTGGATTTGATACACCTC 500 59 苹果茎痘病毒 (ASPV) F: TGCCTCAAAGTACACCCCTCAGT R: CGCCAAGAAATGCACAGC 316 58 苹果坏死花叶病毒 (ApNMV) F: ATGGTGTGCAATCGCTGTCA R: CATCGACCATAAGGATATCA 640 50 苹果锈果类病毒 (ASSVd) F: CCGGTGAGAAAGGAGCTGCCAGCA R: CCTTCGTCGACGACGACAGGTGAG 3
21、33 57 苹果凹果类病毒 (ADFVd) F: GAGGAAAACTCCGTGTGGTTC R: AAGTCCACTCCCTGCCAGACC 271 55 A.5 结果判定 检测时设置阴性对照 （健康、 不带毒样品） 、 阳性对照 （带有病毒或类病毒的毒源材料） ， 采用1.2 % 琼脂糖凝胶电泳进行检测，150 V电压电泳约30 min，用0.5 g/ml溴化乙锭染色10 min或将核酸染料 直接加入琼脂糖凝胶中。 在凝胶成像仪中观察条带， 如出现与阳性对照核酸大小相同的特异性目的条带， 说明样品带毒；如与阴性对照一样，未观察到目的条带，说明样品健康不带毒。 DB37/T 3479 2018 7 _
