1、 ICS 65.020.01 B 05 DB36 江 西 省 地 方 标 准 DB36/T 11902019 灌木辣椒种质SSR分子标记鉴定技术规程 Technical regulations for identification of capsicum frutescens germplasm by SSR molecular marker 2019 - 12 - 27发布 2020 - 06 - 01实施 江西省市场监督管理局 发布 DB36/T 11902019 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 原理.1 5 主要仪器设备与试剂耗材.2
2、 6 试剂配制.2 7 核心引物.2 8 参照种质.2 9 操作步骤.2 10 指纹比对.4 11 结果判定.4 附录A（资料性附录） 主要仪器设备与试剂、耗材.5 附录B（规范性附录） 试剂配制.6 附录C（规范性附录） 核心引物.8 附录D（资料性附录） 参照种质.9 DB36/T 11902019 II 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的的规则起草。 本标准由江西省农业农村厅提出并归口。 本标准起草单位：江西省农业科学院蔬菜花卉研究所。 本标准主要起草人：周坤华、方荣、陈学军、袁欣捷、郭丽虹、罗海平、黄国东、袁青云、涂年生。 DB36/T 11902019 1 灌木辣椒种
3、质SSR分子标记鉴定技术规程 1 范围 本标准规定了利用简单重复序列（Simple sequence repeats，SSR）分子标记法快速鉴定灌木辣椒 （Capsicum frutescens L.）种质技术有关的术语和定义、原理、主要仪器设备与试剂耗材、试剂配制、 核心引物、参照种质、操作步骤、指纹比对、结果判定。 本标准适用于灌木辣椒（Capsicum frutescens L.）种质的SSR分子指纹比对鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本使用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件
4、。 GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 待测种质 germplasm to be tested 待鉴定的疑似灌木辣椒种质，由送检人提供。 3.2 指纹图谱 fingerprint 采用SSR引物扩增出的DNA片段，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到不同大小的DNA片段图谱。 3.3 指纹比对 fingerprint intercomparison 将待测种质与参照种质的SSR指纹图谱进行比对，分析待测种质与参照种质的SSR指纹是否有差 异，并确定其大小。 4 原理 SSR分子标记，广泛分布于辣椒基因组中。不同种质间每个SSR位点
5、重复单位的数量可能不同，因 而形成SSR标记多态性。由于每个SSR位点两侧的序列一般是相对保守的单拷贝序列，因此，可根据其 两侧的序列设计一对特异引物，利用PCR技术对两条引物间的DNA序列进行扩增。通过电泳分离得到 DB36/T 11902019 2 大小不同的扩增产物片段，经硝酸银染色加以区分。因此，根据SSR位点的多态性，利用PCR扩增和电 泳技术可以鉴定灌木辣椒种质。 5 主要仪器设备与试剂耗材 主要仪器设备与试剂、耗材参见附录A。 6 试剂配制 试剂配制方法参见附录B。 7 核心引物 从120对SSR引物筛选出来，可以鉴定灌木辣椒种质的特异性SSR引物。相关信息参见附录C。 8 参照
6、种质 参照种质为用于与待测种质进行指纹比对的若干标准灌木辣椒种质和一年生辣椒种质（Capsicum annuum L.），在进行等位变异检测时，应同时包括相应参照品种。参照种质参见附录D。 9 操作步骤 9.1 样品准备 种子样品的扦样和保存，按照GB/T 3543.2的规定执行。选取每个待测种质和参照种质的样株10株， 每株取新鲜、幼嫩、健康叶1片混合制样并做好标记，用纱布包好并置于液氮罐中。 9.2 DNA提取 采用改良CTAB法或试剂盒法提取样品DNA，试剂盒法按试剂盒说明书进行提取。改良CTAB法DNA 提取步骤如下： a）将混合样品放入研钵中用液氮磨成粉末，然后迅速将粉末勺入2mL离
7、心管的2/5处，加入预热至 65 的CTAB提取液1mL（加入前先加1%的-巯基乙醇），充分混匀后将离心管放入65水浴锅中，水 浴60min，每隔5min摇荡一次，使之充分反应； b）取出离心管静置数分钟后放入4 高速低温离心机中，13000rpm离心15min。取上清液至另一离 心管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）后，充分混匀，静置10 min，13000 rpm离心10 min； c）取上清液800L置于新的1.5mL离心管中。加入2/3体积冷的异丙醇，轻晃，置于-20冰箱30 min 或者过夜； d）取出步骤c的离心管在4条件下，13000rpm离心10min，弃上清。
8、用75%乙醇洗涤DNA两次， 自然晾干； e）向1.5mL离心管中加入ddH2O 200 L溶解DNA，再加10mg/mL的RNaseA 5L，置37水浴60min。 加入预冷的氯仿:异戊醇（24:1）200L混匀，静置10min，12000 rpm离心10 min； f）取上清加入1/10体积的NaAc（3mol/L），2倍体积冷的无水乙醇。-20放置30min或更长时间， 在4下13000rpm，离心15min。用冷的75%乙醇洗涤沉淀两次，自然晾干； DB36/T 11902019 3 g）加200L灭菌1TE溶解DNA，并用核酸测定仪检测DNA浓度，将DNA稀释到20ng/L，并放入
9、-20冰箱保存备用。 9.3 PCR扩增 9.3.1 PCR反应体系 PCR反应体系：总体积10L，其中1LBuffer（10），0.8 LMg2+（25 mM），0.2LdNTPs（10mM）， 0.4L上游引物（10mM），0.4L下游引物（10mM），0.1LTaq酶（5U/l），2LDNA模板（20ng/L）， 5.1Ldd H2O。 9.3.2 PCR反应程序 PCR反应程序：（1）94 预变性4min；（2）94 变性45s；（3）按附录C 推荐的引物退火温度 退火45s；（4）72 延伸45s；（5）重复步骤（2）（4），共35个循环；（6）72延伸10min；（7） 4 保存。
10、 9.4 PCR扩增产物检测 9.4.1 变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳 9.4.1.1 玻璃板处理 用自来水分别清洗干净长、短两块玻璃板，晾干后用95%酒精淋洗玻璃板表面，晾干后用擦镜纸将 500L亲和硅烷工作液均匀涂在长玻璃板上，将500L剥离硅烷均匀涂在带有凹槽的短玻璃板上。约4 min5 min后，用蘸有95%酒精的擦镜纸擦拭玻璃板2次，除去玻璃板上多余的亲和硅烷和剥离硅烷。 9.4.1.2 组装玻璃板 将长板平放，用厚度为0.4mm干净的垫片放于玻璃板的左右两侧，将带有凹槽的短板压于其上形 成胶室，并使两块玻璃板底部和垫片对齐，然后用夹子夹紧两侧，用水平仪检测玻璃胶室是否水平。 9.4.
11、1.3 制胶 取75mL的6%聚丙烯酰胺凝胶溶液至烧杯中，加500L的10%过硫酸胺（APS）与50L的TEMED后， 摇匀后迅速将胶液灌入玻璃胶室，待胶室灌满后，在凹槽处鲨鱼齿朝外轻轻插入样品梳至适当位置，在 室温下聚合1h以上。凝胶聚合后，轻轻拔出样品梳，清洗凹槽处残留的凝胶。 9.4.1.4 预电泳 将胶板垂直固定于电泳槽上，上槽加入约1200mL的1 TBE电泳缓冲液，约高出凹槽板2cm左右， 下槽加入500mL的1TBE电泳缓冲液，再次用胶头滴管将凹槽处剩余凝胶碎片冲出。设定电压2000V、 电流100mA、恒功率100W条件下预电泳20min。 9.4.1.5 样品制备 在10LP
12、CR产物中加入4L上样缓冲液，混匀后，在PCR仪上94变性4min后取出，立即将PCR板 放入碎冰上冷却10min。 9.4.1.6 点样及电泳 DB36/T 11902019 4 预电泳结束后，用胶头滴管吹走加样孔内气泡，并将鲨鱼梳正向插入凝胶，齿尖入胶深度以不超过 lmm为宜。每个加样孔加入5L待测样品和参照样品，在胶板两侧点入DNA Marker。设定电压2000V、 电流100mA、恒功率60W条件下电泳，在溴酚蓝指示剂接近胶板底部时停止电泳。 9.4.2 银染检测 快速银染法步骤如下： a) 分开长、短玻璃板：电泳结束后，小心地将长、短玻璃板分开，凝胶应粘在长玻璃板上； b) 洗胶：
13、将长玻璃板胶面朝上放入装有超纯水的托盘A中，漂洗2次，每次15s，再将玻璃板取出， 竖直放置10s20s； c) 染色：在托盘B中加入1.2L染色液，将长玻璃板胶面朝上放入托盘B，并放置摇床上轻摇10min。 d) 洗胶：从托盘B取出玻璃板，并放入装有超纯水中的托盘A清洗胶面约5s； e) 显色：从托盘A取出玻璃板沥水后，立即放入盛有预冷显影液的托盘C中，并放在摇床轻摇5min 7min至条带清晰呈现，不宜显色太久； f) 洗胶：用自来水冲洗玻璃板2min，将胶上多余的NaOH溶液洗去。； g) 干胶：通过热对流或室温放置，使胶变干。 10 指纹比对 每个样品SSR位点的等位变异采用扩增片段大
14、小的形式表示。根据待测种质与参照种质的SSR条带 位置，确定是否有差异，并根据DNA Marker和待测样品条带的位置比较分析，确定待测种质和参照种 质的片段大小。 11 结果判定 用附录C中引物进行检测，若待测种质能扩增出与参照种质中的标准灌木辣椒种质相同条带时，则 判定待测种质为灌木辣椒（C. frutescens）种质；若待测种质不能扩增出与参照种质中的标准灌木辣椒 种质相同条带时，则判定待测种质不是灌木辣椒（C. frutescens）种质。 DB36/T 11902019 5 A A 附 录 A （资料性附录） 主要仪器设备与试剂、耗材 A.1 主要仪器设备与试剂、耗材 主要仪器设备
15、与试剂、耗材见表A.1。 表A.1 主要仪器设备与试剂、耗材 步骤/类别 主要仪器设备 主要试剂 （试剂均使用分析纯试剂） 主要耗材 DNA提取 高压灭菌锅、高速冷冻离心机、 核酸测定仪、微量移液器、纯 水仪、恒温水浴锅、电子天平、 磁力搅拌器、PH计 十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）、 聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、乙二铵 四乙酸二钠、氯化钠、三羟甲基氨基 甲烷（Tris碱）、浓HCl、Tris饱和酚、 -巯基乙醇、RNase A、氯仿、异戊 醇、无水醋酸钠、无水乙醇、液氮 离心管（1.5mL，2mL）、 移液器配套枪头、配套枪 头盒、研钵、研棒、烧杯、 量筒、棕色瓶、玻璃棒、 PE手套、乳胶
16、手套 PCR扩增 PCR扩增仪器、制冰机 98%去离子甲酰胺、溴酚蓝、二甲苯 青、DNA Marker、矿物油、Taq DNA 聚合酶、SSR引物、dNTPs、10 Buffer 缓冲液、Mg2+ 96孔PCR板 聚丙烯酰胺 凝胶电泳 高压电泳仪、垂直电泳槽及配 套的制胶附件 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、硼酸、 尿素、亲和硅烷、剥离硅烷、过硫酸 铵(APS)、四甲基乙二胺（TEMED） 滤纸、漏斗、长玻璃板、 短玻璃板、胶头滴管 银染检测 水平摇床、胶片观察灯 甲醛、硝酸银、氢氧化钠、无水碳酸钠 托盘 DB36/T 11902019 6 B B 附 录 B （规范性附录） 试剂配制 B.1 DN
17、A提取试剂的配制 B.1.1 1mol/L Tris-HCl溶液（PH=8.0） 称取24.22g Tris碱置于250mL烧杯中，加入约160mLddH2O，充分搅拌，加入约8.4mLHCl调pH值至 8.0，加ddH2O定容至200 mL，121高压灭菌20min。 B.1.2 0.5mol/L EDTA溶液（PH=8.0） 称取37.22g Na2EDTA2H2O置于250mL烧杯中，加入约160mLddH2O，充分搅拌，用固体NaOH调pH 值至8.0，加ddH2O定容至200mL，121高压灭菌20min。 B.1.3 2%CTAB溶液 称取20g CTAB，81.9g NaCl，1
18、0g PVPP置于1000mL烧杯中，加入约500mLddH2O搅拌，再加入1mol/L Tris-HCl（pH=8.0）溶液100mL，0.5mol/L EDTA（pH=8.0）溶液40mL，65水浴溶解，加ddH2O定容 至1000mL，121 高压灭菌20min。 B.1.4 酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）溶液 量取100mLTris饱和酚的下层有机相，96mL氯仿，4mL异戊醇置于棕色瓶中，充分混匀。 B.1.5 氯仿/异戊醇（24:1）溶液 量取240mL氯仿，10mL异戊醇置于玻璃瓶中，充分混匀。 B.1.6 3mol/LNaAc溶液（PH=5.2） 称取12.34g无水NaA
19、c置于100mL烧杯中，加入约20mLddH2O，搅拌溶解，用冰醋酸调pH值至5.2， 加ddH2O定容至200mL，121高压灭菌20min。 B.1.7 1TE buffer溶液 用移液器吸取1mol/L Tris-HCl（pH=8.0）溶液1mL，0.5mol/L EDTA（pH=8.0）溶液200L，加ddH2O 定容至100mL，121高压灭菌20min。 B.1.8 75% 酒精溶液 量取150mL无水乙醇，50mLddH2O置于烧杯中，充分混匀。 B.2 PCR扩增试剂的配制 B.2.1 SSR引物稀释 DB36/T 11902019 7 合成的核心引物（见附录C）先在高速离心机
20、中5000r/min离心20s，根据引物说明书稀释到工作液 浓度10mol/L。 B.3 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳相关试剂的配制 B.3.1 10TBE缓冲液 分别称取Tris碱108g，硼酸55g置于1000mL烧杯中，量取0.5mol/L EDTA（pH=8.0）溶液40mL，加 超纯水定容至1000mL。 B.3.2 40%丙烯酰胺凝胶溶液 分别称取丙烯酰胺380g和甲叉双丙烯酰胺20g置于1000mL烧杯中，加入600mLddH2O慢慢搅拌，37 水浴溶解，定容至1000mL，过滤，4 保存。 B.3.3 6%变性聚丙烯酰胺凝胶溶液 称取420g尿素置于1000mL烧杯中，再分别加入10
21、0mL的10TBE缓冲液和40%丙烯酰胺凝胶溶液 150mL，加入600 mLddH2O慢慢搅拌，37 水浴溶解，加超纯水定容至1000mL。 B.3.4 10% APS溶液 称取5g过硫酸铵，加入50mL的ddH2O溶解，4 保存一周即更换。 B.3.5 1TBE缓冲液 量取10TBE缓冲液100mL，用超纯水定容至1000mL。 B.3.6 上样缓冲液 分别称取溴酚蓝25mg，二甲苯青25mg置于玻璃瓶中，加入98%去离子甲酰胺98mL和0.5mol/L的 EDTA（pH=8.0）溶液2mL，混匀。 B.4 银染检测试剂的配制 B.4.1 染色液 称取硝酸银1.2g，加超纯水定容至1200
22、mL。 B.4.2 显色液 称取NaOH 24g，无水碳酸钠0.48g，加超纯水定容至1200mL，4冰箱保存。显影前量取5mL甲醛 倒入显色液中。 DB36/T 11902019 8 C C 附 录 C （规范性附录） 核心引物 C.1 核心引物 核心引物见表C.1。 表C.1 核心引物 编号 引物名称 引物序列(53) 退火温度 灌木辣椒 扩增片段 bp 1 Hpms 1-106 F: TCCAAACTACAAGCCTGCCTAACC R: TTTTGCATTATTGAGTCCCACAGC 59 200 315 2 Hpms 1-274 F:TCCCAGACCCCTCGTGATAG R:T
23、CCTGCTCCTTCCACAACTG 60 176 252 3 HpmsE015 F: TTGTGAGGGTTTGACACTGGGA R: CCGAGCTCGATGAGGATGAACT 60 210 305 4 HpmsE100 F:AGCAGGAAACAATGACCGGAAA R: CCTACAGGAGCAATGCCTTTCG 58 320 520 DB36/T 11902019 9 D D 附 录 D （资料性附录） 参照种质 D.1 参照种质名单 参照种质名单见表D.1。 表D.1 参照种质名单 编 号 样品名 分 类 来源 编号 样品名 分 类 来 源 1 定南米椒 C. frute
24、scens 江西 10 同安小米椒 C. annuum 福建 2 高安小米椒 C. frutescens 江西 11 开江七星椒 C. annuum 四川 3 信丰米椒 C. frutescens 江西 12 一撮椒 C. annuum 四川 4 大米椒 C. frutescens 云南 13 武平甜椒 C. annuum 福建 5 中91-2 C. frutescens 云南 14 习水线椒 C. annuum 贵州 6 中92-1-1 C. frutescens 云南 15 大金条 C. annuum 四川 7 中96 C. frutescens 美国 16 梅花椒 C. annuum 辽宁 8 中97-1 C. frutescens 海南 17 特大牛角椒 C. annuum 黑龙江 9 中98-1 C. frutescens 海南 18 樱桃椒 C. annuum 云南 _
