1、 ICS 65.020.20 B 15 DB36 江西省 地方标准 DB36/T 1036-2018 芝麻细菌性青枯病诊断及检测技术规程 Techniquely Rules for Diagnosis and Detection of Sesame Bacterial WiltRalstonia solanacearum Smith 2018 - 07 - 03发布 2019 - 01 - 04实施 江西省质量技术监督局 发布 DB36/T 1036-2018 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 术语和定义 . 1 3 症状诊断 . 1 4 病原菌形态学鉴定与致病性测定 . 1
2、5 病原菌 PCR检测 . 2 附录 A（资料性附录） 培养基配制方法 . 3 附录 B（资料性附录） PCR检测引物、反应体系条件 . 4 DB36/T 1036-2018 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由江西省农业 厅 提出 并归口 。 本标准起草单位：江西省农业科学院植物保护研究所 、江西生物科技职业学院 。 本标准主要起草人：华菊玲、李信申、 黄小梅、 刘清兰、熊艳、黄瑞荣 、 王希 、 史建苗 、 盛琦 、 饶 喜 。 DB36/T 1036-2018 1 芝麻细菌性青枯病诊断及检测技术规程 1 范围 本标准规定了芝麻 细菌性青枯病（ S
3、esame bacterial wilt）诊断及检测技术 的术语和定义、症状 诊断、 病原菌形态学鉴定与致病性测定 和 病原菌 PCR检测 。 本标准适用于芝麻细菌性青枯病症状诊断、病原菌形态学鉴定及 PCR检测。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本 文件 。 2.1 16s rRNA序列 细菌染色体上编码 rRNA 相对应的 DNA 序列，存在于所有细菌的染色体基因组中。具有高度的保 守性和特异性。 16s rRNA 基因检测技术已成为病原细菌检测和鉴定的重要方法。 2.2 ITS序列 16S 23S rRNA基因区间的一段高度可变 序列，该区域种间多态性丰富，而种内却非常保守，这 些特
4、点使得它在细菌分类鉴定研究上具有独特的优势。 3 症状诊断 初期在茎杆上出现暗绿色水浸状斑块，继而呈黑褐色条斑向上下扩展，顶梢常有 2个 3个梭形溃疡 状裂缝，部分病茎溃疡 状 裂缝可延伸至茎杆中下部，溃疡状裂缝出现早而多的病株常呈畸形。 病株顶端 先出现萎蔫，继而整株呈失水状， 早期 夜间可恢复正常，后期则呈黑褐色枯死。病株茎部维管束变褐色， 髓部空洞。折断茎杆常可见菌脓形成的透明细丝。茎杆表皮下常可见泡状隆起，刺破后有乳 白 色菌脓溢 出，渐成为漆黑色晶亮的颗粒 。 4 病原菌形态学鉴 定与致病性测定 4.1 菌株分离与形态学鉴定 4.1.1 菌株分离 采集典型的芝麻细菌性青枯病标本，剪取
5、病健交界处病茎 3cm 4cm，经 75%酒精消毒、灭菌水冲洗 后，剪去两头取中间段置于装有 5ml 10ml无菌水的试管中静置 5min左右至悬浮液变混浊，用接种环蘸 DB36/T 1036-2018 2 取少量粗悬液分别在 NA平板和 TZC平板上划线或涂布。 28 培养 72h后观察菌落形态。 挑取典型菌落，进 行 光学显微镜下 菌体 的 革兰氏染色、鞭毛染色和形态观察。 4.1.2 形态 学 鉴定 根据以下形态学特征作为鉴定依据。 青枯菌革兰氏染色反应为阴性，菌体杆状，具 1根 4根极鞭， 无荚膜。 在 NA培养基平板上于 28 培养 72h， 见 附录 A， 菌落呈污白色，平滑有光泽
6、，呈粘液状，直径 2mm 3mm。 在 2,3,5-氯化三苯基四氮唑（简称 TZC，下同）选择性培养基上， 28 培养 72h，产生的菌落呈不 规则圆形，具流动性，中心呈红色至桔红色，边缘为白色，菌落直径 2mm 5mm。 4.2 菌株致病性测定 4.2.1 接种体制备 将 形态学鉴定为 青枯 菌 (R. solanacerum)的菌株 于 NA平板上培养活化 48h后 ， 配成 1108 CFU/ml菌悬 液供接种备用。 4.2.2 接种期 芝麻初花期 进行接种 。 用制备的 菌悬液，回接芝麻健株，并以无菌水 作为对照。 4.2.3 接种方法 在 26 30 温室保湿条件下，采用以下 3种方
7、法接种 ： 剪叶接种 ： 选择完全展开的叶片，用灭菌剪刀蘸取菌液 剪叶 ； 针刺接种 ： 用灭菌的小号注射器抽取菌液，在茎杆中部叶腋处针刺注射菌液，每株注射 菌液 0.1ml； 伤根灌菌液接种 :用小铁铲从距茎基 2cm 3cm处斜插入土，随后每株灌入菌液 30ml。 4.2.4 结果调查 接种 10d 14d后，观察接种植株是否产生典型 症状。选取典型症状的植株，再次进行病菌分离和形 态学对比观察。从中 选取典型菌株进行 PCR检测。 5 病原菌 PCR检测 5.1 特异性引物合成 16S rRNA 引物序列 、 16S 23S rRNA 基因区间 ITS 引物序列见附录 B。 5.2 PC
8、R扩增 以青枯菌标准菌株 GMI 1000为阳性对照 ，以灭菌双纯水为阴性对照。取无菌条件下培养 的待检测 菌 株 菌液少许为模板 进行扩增 。 5.3 琼脂糖凝胶电泳 取扩增样品 5l，加入 1l 6倍上样缓冲液（ 6loading buffer），混匀，点样于 1.0%的琼脂糖凝 胶（含 0.05l/ml EB或 Goldview）上样孔中，用 0.5TBE缓冲液在 5V/cm 8V/cm电压条件下电泳 30 min。 5.4 菌株 16SrRNA、 ITS序列测定与分析 DB36/T 1036-2018 3 对 5.3获得的 阳性克隆进行序列测定。将测定得到的各菌株 16S rRNA序列
9、、 ITS序列与 GenBank中 核 酸数据进行 BLAST对比分析，判定各待测菌株与标准模式菌株的同源性。 DB36/T 1036-2018 4 A A 附 录 A （资料性附录） 培养基配制方法 A.1 NA培养基 牛肉浸膏 3g，酵母浸膏 1g，蛋白胨 5g，葡萄糖或蔗糖 10g，琼脂 18g 20g，蒸馏水 1000ml， pH7.4 7.6。 高压 湿热 121 灭菌 25min。 A.2 TZC培养基配制 1%TZC溶液配制：称取 1g TZC，用蒸馏水溶解并定容至 100ml，用过滤法灭菌，避光保存备用。 TZC 培养 基制作：分别称取蛋白胨 2g，水解酪蛋白 0.2g，葡萄糖
10、 2g，琼脂粉 4g。依次加入 200ml 蒸馏水中。加热溶化后，装入 250ml 三角瓶中，每瓶装 200ml。 121 高压 湿热 灭菌 25min 后，培养基冷却至 45 左右时，于无菌条件下加入已灭菌的 1% TZC 溶液 0.5ml，摇匀 后倒入灭菌的培养皿中。 DB36/T 1036-2018 5 B B 附 录 B （资料性附录） PCR检测引物、反应体系条件 B.1 PCR引物 B.1.1 16S引物序列分别为 5-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3； 5-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3。扩增片段大 小为 1523 bp。 B.1.2 ITS引物序列为
11、 5-AGTCGTAACAAGGTAGCCGT-3； 5-GTGCCAAGGCATCCACC-3。扩增片段大小为 591 bp。 B.2 PCR反应体系 25 LPCR 反应体系 ： 试剂名称 用量 10PCR 反应缓冲液（ Buffer） 2.5 L MgCl2(25 mmolL-1) 2.0 L dNTP(2.5 mmolL-1) 2 L 引物 -F(20 molL-1) 0.5 L 引物 -R(20 molL-1) 0.5 L Taq DNA 聚合酶 (5 UL-1) 0.25 L 模板（ template） 0.5 L ddH2O 16.75 L total 25 L B.3 PCR反应条件 DB36/T 1036-2018 6 反应 条件 为： 95 预变性 5min； 94 30s， 56 30s， 72 1min， 35个循环； 72 7min。采用胶 回收法回收 。 B.4 序列测定 PCR产物进行制备型琼脂糖凝胶电泳， 凝胶成像仪 紫外透射光下观察是否扩增出预期的特异性 DNA 条带。选取阳性克隆进行序列测定 。 _
