1、ICS 65.020.20 B 16 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 33052018 石榴干腐病检测与鉴定技术规程 Detection and Identification of Pilidiella granati 文稿版次选择 2018 - 12 - 29 发布 2019 - 01 - 29 实施 安徽省市场监督管理局 发布 DB34/T 33052018 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所提出。 本标准由安徽省动植物检验检疫标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位：安徽省农业科学院植物
2、保护与农产品质量安全研究所，安徽省农业科学院园 艺研究所，淮北市农业委员会，怀远县淮西石榴研究所，怀远县园艺站。 本标准主要起草人：杨雪、徐义流、陈雨、秦改花、朱军、谷春艳、张爱芳、臧昊昱、高同春、戚仁 德、刘长华、娄志。 DB34/T 33052018 1 石榴干腐病检测与鉴定技术规程 1 范围 本标准规定了石榴干腐病（pomegranate dry rot）的检测与鉴定技术。 本标准适用于石榴的枝干、果实中石榴干腐病病菌的检测和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有
3、的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 石榴干腐病的症状与病原菌 病原菌：石榴壳座月孢（ Pilidiella granati） 分类地位：属真菌界 Fungi，子囊菌门 Ascomycota，子囊菌纲 Sordariomycetes， 间座壳目 Diaporthales，黑盘孢科 Mel anconidaceae，壳座月孢属 Pilidiella。 其他信息参见附录A。 4 方法原理 本方法以 PCR 鉴定和致病性鉴定为主要判定依据，石榴干腐病菌的形态特征作为辅助鉴定依据。 5 仪器设备 5.1 高速离心机：转速15000 r/min 5.2 涡旋振荡
4、器 5.3 PCR 仪 5.4 高压灭菌锅 5.5 恒温培养箱：2030 5.6 冰箱：4、-20、-70 5.7 恒温水浴锅：4100 5.8 电泳仪 5.9 凝胶成像仪 5.10 可调移液器：1-10 L，10 L-100 L，100 L-1000 L 5.11 天平：精度 0.001 g 5.12 纯水仪 5.13 超净工作台 DB34/T 33052018 2 5.14 显微镜：物镜头 10 40 6 试剂和培养基 6.1 PCR 试剂：2 PCR Taq Master Mix 6.2 凝胶电泳试剂：琼脂糖、TAE 电泳缓冲液（Tris 4.84 g，Na 2EDTA2H20 0.75
5、 g，冰乙酸 1.142 mL， 蒸馏水 1000 mL， pH 8.5） 6.3 DNA 提取试剂：CTAB 提取液（Tris-HCl(pH 8.0) 100 mmol/L，EDTA 20 mmol/L，NaCl 1.4 mol/L， CTAB 2(w/v)，蒸馏水 1000 mL，巯基乙醇(用时 加入) 40 mmol/L），无水乙醇，10SDS，酚/氯仿/ 异戊醇（25：24：1）， 氯仿，异丙醇，TE（Tris-HCL10 m mol/L，EDTA 1 mm ol/L，pH 8.0） 6.4 培养基：WA 培养基（琼脂粉 20 g，水 1000 mL）、PDA 培养基（去皮马铃薯 20
6、0 g，葡萄糖 20 g， 水 1000 mL，琼脂粉 20 g） 6.5 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水符合 GB/T 6682 中三级水的标准。 7 实验室鉴定 7.1 病原菌分离与纯化 将石榴病果用 75乙醇表面消毒后，用无菌水清洗 1 次，于病健交界处取少量组织置于 WA 培养 基中培养。待长出菌丝后，转至 PDA 培养基平板上，28恒温培养，并观察培养性状（参见附录A.2） 和孢子形态（参见附录A.3）。进行单孢分离与纯化后，用于 PCR 鉴定。 7.2 PCR 鉴定 7.2.1 病原菌 DNA 提取 从培养好的菌落边缘用打孔器取 10 块直径为 5 mm 的菌
7、碟，转至 PDA 液体培养基，28振荡培 养 5 d，过滤收集菌丝，经液氮冷冻研磨成粉，加入 900 L 2 CTAB 提取液和 90 L 10 SDS， 涡旋混匀，于 60水浴 1 h，期间每隔 10 min 上下颠倒几次，常温条件下 12000 rpm 离心 10 min； 取上清，加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），颠倒混匀，常温条件下 12000 rpm 离心 5 min； 将上清转移至新的 EP 管中，加入等体积氯仿，轻轻颠倒 混匀，常温条件下 12000 rpm 离心 5 min； 上清转移至新 EP 管中， 加入 1 倍于上清体积的异丙醇， -20条件沉淀 15 min
8、； 常温条件下 12000 rpm 离心 5 min，倾去上清，沉淀用 70乙醇洗涤 2 次，37条件下待乙醇挥发干；加适量灭菌超纯水或 者 TE（pH 8.0）溶解沉淀（含 20 g/ml RNase），37消解 30 min 后电泳检测，-20保存备用。 7.2.2 PCR 引物 利用 GenBank 通过序列分析比较，根据 ITS 序列差异设计一对特异性引物。 GF-F：5 - AAGGACACAACCCCAGATAC -3； GF-R： 5 - ATAAACTACTACGCTCAGAG -3。 7.2.3 PCR 体系 反应体系为：2 PCR Taq Master Mix 25 L，1
9、0 mol/L 引物各 2 L、DNA 4 L，灭菌双蒸水补 足至 50 L。 7.2.4 PCR 程序 DB34/T 33052018 3 反应程序为：94 5 min； 94 30 s，52 30 s，72 30 s，30个循环；72 5 min。 7.2.5 PCR 结果判定 PCR 鉴定用标准石榴干腐病菌 DNA 作阳性对照 ，无菌水作阴性对照。扩增产物用 1.5琼脂糖凝 胶在 1 TAE 缓冲液中电泳，用凝胶成像系统分析。若阳性对照出现一条 450 bp 的 DNA 片段，阴性 对照没有条带，待鉴定菌株能扩增出该 450 bp 的片段，则判定为石榴干腐病。 7.3 致病性鉴定 根据科
10、赫氏法则，用分离鉴定的石榴干腐病病原菌接种健康的石榴果实组织诱导发病，观察发病症 状与田间石榴干腐病自然发病症状是否一致。将发病果实进行病原菌的分离与鉴定，观察分离的病原菌 与接种病原菌是否一致。 8 结果判定 如 PCR 鉴定结果符合 7.2.5，且致病性鉴定结果符合 7.3，则判定为检出石榴干腐病。 9 样品、菌株保存 9.1 样品保存 检疫鉴定后保存样品，以备复验、谈判和仲裁。由鉴定人标识确认、样品管理员登记，置于 -70 冰箱保存。保存期为一年，有特殊需求保存期可适当延长。 保存期满灭活处理。 9.2 菌株保存 分离并鉴定为石榴干腐病菌的菌株，应妥善保 存。短期保存可将菌株接种到 PD
11、A 培养基斜面上， 28 培养 3 d，直接置于 4冰箱保存。长期保存可将菌株接种到 PDA 培养基上，28培养 3 d，将 菌丝体制成冻干粉，置于 -70冰箱保存。 对不需要保存的菌株应及时灭活处理。 DB34/T 33052018 4 A A 附 录 A （资料性附录） 石榴干腐病的基本信息 A.1 分布 在我国山东、安徽、河南、陕西、四川等产区均有发生。 A.2 病害症状 以果实为害为主，在蕾期、花期发病，花冠变褐，花萼产生黑褐色椭圆形凹陷小斑。幼果发病首先 在表面发生豆粒状大小不规则浅褐色病斑，逐渐扩为中间深褐，边缘浅褐的凹陷病斑，再深入果内，直 至整个果实变褐腐烂，在花期和幼果期严重受害后造成早期落花落果；果实膨大期至初熟期，则不再落 果，而干缩成僵果悬挂在枝梢（见图A.1）。 图A.1 石榴干腐病为害果实症状 A.3 病原菌培养性状 PDA 培养基上培养 34 天后，长出 绒毛状白色菌落，同心轮纹状，菌落呈放射状生长，约 7 天 后产生黑褐色分生孢子器（见图A.2）。 分生孢子呈纺锤形，淡褐色，表面光滑，直或微弯，无隔膜，1015 m 2.53.5 m（见图A.3）。 DB34/T 33052018 5 图A.2 石榴干腐病菌的培养形态特征 图A.3 石榴干腐病菌的孢子形态特征 _
