1、ICS 11.220 B 41 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 32842018 猪丹毒丝菌实时荧光 PCR 检测方法 Method of the real-time PCR for the detection of Erysipelothrix rhusiopathiae 文稿版次选择 2018 - 12 - 29 发布 2019 - 01 - 29 实施 安徽省市场监督管理局 发布 DB34/T 32842018 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽农业大学提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：安徽农业大学
2、、安徽浩翔农牧有限公司、安徽省动物卫生监督所、巢湖市畜牧兽 医局、阜阳市动物卫生监督所、合肥市动物疫病预防与控制中心、安徽省兽药饲料监察所，同济大学。 本标准主要起草人：李郁、李雪松、李春芬、张利亚、陈章、黄晓慧、孙裴、姚焱彬、张劲松、高 亚飞、孟天恺。 DB34/T 32842018 1 猪丹毒丝菌实时荧光 PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了猪丹毒丝菌实时荧光 PCR 检测方法的缩略语、试剂和仪器、样品的采集、运输与保 存、操作方法。 本标准适用于猪组织样品、血样及其细菌培养物中猪丹毒丝菌的实时荧光 PCR 检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的
3、引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 荧光 PCR：荧光聚合酶链式反应 Ct 值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环圈数 DNA：脱氧核糖核酸 Taq 酶：Taq DNA 聚合酶 PBS：磷酸盐缓冲液 Eppendorf 管：微量离心管 4 试剂和仪器 4.1 试剂 4.1.1 无水乙醇: -20预冷。 4.1.2 75乙醇: 用新开启的无水乙醇和无 DNA 酶的灭菌双蒸水配制，-20预冷。 4.1.3 灭菌双蒸水。
4、 4.1.4 动物组织基因组 DNA 提取试剂盒。 4.1.5 引物： 上游引物：5-GTGGCGCATAT AATCCCGTA- 3 下游引物：5- GCAAACGCAA TGGCTTCT- 3 4.1.6 2TransTaq-T PCR SuperMix。 4.1.7 Taq 酶。 4.1.8 实验用水：应符合 GB/T 6682 中一级水的规格。 4.2 仪器 DB34/T 32842018 2 4.2.1 显微镜：物镜 10 倍100 倍。 4.2.2 电子天平：感量 0.1 g。 4.2.3 恒温培养箱：36 1 4.2.4 冰箱：（28，-20，-80）。 4.2.5 微量移液器：
5、0.1 L2.5 L、0.5 L10 L、5 L50 L、20 L200 L、100 L1 000 L。 4.2.6 荧光 PCR 仪。 4.2.7 恒温水浴锅（室温至 100）。 4.2.8 高速台式冷冻离心机：最大转速 14 000 r/min 以上。 4.2.9 全自动快速样品研磨仪。 4.2.10 混匀器 5 样品的采集、运输与保存 5.1 采样要求 采样过程中样品不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。 5.2 采样工具 5.2.1 剪刀、镊子、注射器、1.5 mL Eppendorf 管。 5.2.2 所有上述采样工具必须经(121 士 2)，15 min 高压灭菌并烘
6、干。 5.3 样品的采集 5.3.1 组织器官 根据临床症状的不同采集典型病料。用剪刀、镊子无菌采集肾、脾、肝、心血、淋巴结、疹块及其 周围皮肤、肿胀的关节液、心脏瓣膜增生物等。 5.3.2 血清或全血 用无菌注射器直接吸取至无菌 Eppendor f 管，分离血清。或用加有抗 凝剂的注射器直接吸取至无 菌 Eppendorf 管，充分混合。抗凝剂采用柠檬酸钠缓冲液，或 0.5 m ol/L EDTA。每 6 mL 血液加 1 m L 抗凝剂。 5.3.3 细菌培养物 直接取液体培养基培养的菌液。对于在固体培养基上生长的菌落，用接种棒挑取适量菌样，放入 0.01 mol/L pH 7.6 PB
7、S 中，振荡混匀形成悬浮菌液。 5.4 样品的运输与保存 采集的样品应置于低温、密封的容器内运输。待检样品在 28条件下保存不应超过 24 h；若 不能在规定时间内送检的，可保存于饱和氯化钠溶液或 30甘油缓冲盐水溶液中，但保存不应超过 72 h。 6 操作方法 DB34/T 32842018 3 6.1 样品前处理 6.1.1 组织器官样品前处理 用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品 10 mg 于研钵中充分研磨，再加 5.0 mL 0 .01 mol/L pH 7.6 PBS 混匀，然后将组织悬液转入无菌 1.5 mL Eppe ndorf 管中，编号备用。 6.1.2 血样、细菌培养物前处理
8、取 1 mL2 mL 全血样品，12000 g 离心 10 min，弃上清；加等体积灭菌双蒸水充分混匀，12000 g 离心 10 min, 弃上清，若红细胞裂 解不完全，出现红色沉淀物，则需 采用灭菌双蒸水重复洗涤 ； 收集 沉淀物，-20贮存备用。 取 1 mL2 mL 血清、细菌培养物，12000g 离心 10 min，弃上清；加 1 mL 0.01 mol/L pH 7.6 PBS，充分振荡混匀，12000g 离心 10 min，弃上清，收集沉淀物，-20贮存备用。 6.2 核酸（DNA）提取 按照动物组织基因组 DNA 提取试剂盒说明书进行。 6.3 DNA 提取后的处理要求 提取后
9、的 DNA 须在 2 h 内进行 PCR 扩增或置于 -80贮存备用。 6.4 荧光 PCR 扩增反应 6.4.1 对照设立 从样品处理开始，应设置阳性对照、阴性对照： 阳性对照：取扩增基因的阳性克隆分子 DNA 或阳性标准菌株 DNA 作为阳性对照。 阴性对照：取无交叉反应的非阳性菌株 DNA 作为阴性对照。 空白对照：在扩增反应阶段设置。以灭菌双蒸水作为模板设置空白对照。 6.4.2 扩增试剂准备 采用反应体系体积为 20 L，含以下成分：2SYBR Premix Taq II 10 L，dd H 2O 6.8 L，上 游引物（10 mol/L） 和下游引物（10 mol/L） 各 0.4
10、 L，50ROX Reference Dye 0.4 L，DNA 模 板 2 L。 根据上述反应体系、按每个反应 18 L 的用量配制荧光 PCR 预混反应液，不足部分加灭菌双蒸水 补足。 将各试剂按使用量吸取到 1.5 mL Eppendorf 管中， 充分混匀， 然后在每个 PCR 光学管中分装 18 L。 6.4.3 加 DNA 模板 在样品处理区进行。在已分装有荧光 PCR 预混反应液的 PCR 光学管中每管分别加入 2 L 样品或 对照的 DNA 模板，混匀，盖上管盖，放入荧光 PCR 仪，记录样品放置顺序。 6.4.4 荧光 PCR 扩增检测 在扩增检测区进行。将 6.4.3 中加
11、 DNA 模板后的 P CR 管放入荧光定量 PCR 检测仪内，记录样品 摆放顺序。 反应参数设置： DB34/T 32842018 4 第一阶段：95 5 min，1 个循环； 第二阶段：95 10 s，61 60 s, 40 个循环，荧光收集设置在 61退火延伸时进行； 第三阶段：55 30 s，95 30 s，1 个循环。 6.5 结果判定 见附录B。 DB34/T 32842018 5 A A 附 录 A （规范性附录） 缓冲液的配制 A.1 柠檬酸钠缓冲液 A.1.1 成分 柠檬酸 5.3 g 柠檬酸钠 15 g 葡萄糖 16.2 g 蒸馏水 1 L A.1.2 制法 将 A.4.1
12、 中各成分溶解于蒸馏水，定容至 1 L，混匀。121高压灭菌 15 min 后储存于 4备用。 A.2 0.5 mol/L EDTA 缓冲液（pH 8.0） A.2.1 成分 EDTA 186.1 g 蒸馏水 1 L A.2.2 制法 称取 186.1 g EDTA 溶解于蒸馏水中，磁力搅拌器上剧烈搅拌，校正 pH 至 8.0，定容至 1 L，分 装，121高压灭菌 15 min 后储存于室温备用。 A.3 0.01 mol/L pH 7.6 PBS A.3.1 成分 氯化钠 4 g 十二水合磷酸氢二钠 1.5 g 氯化钾 0.1 g 磷酸二氢钾 0.1 g 蒸馏水 500 mL A.3.2
13、制法 将 A.2.1 中各成分溶解于蒸馏水中，定容至 500 mL，校正 pH 至 7.6，121灭菌 20 min 备用。 A.4 饱和氯化钠溶液 DB34/T 32842018 6 A.4.1 成分 氯化钠 380390 g 蒸馏水 1 L A.4.2 制法 称取 380390 g 氯化钠溶于蒸馏水中，定容至 1 L。分装于灭菌广口瓶中，每瓶 200 mL，121 高压灭菌 15 min 备用。 A.5 30甘油缓冲盐水溶液 A.5.1 成分 氯化钠 5 g 碱性磷酸钠 10 g 中性甘油 300 mL 蒸馏水 1 L A.5.2 制法 先将氯化钠和碱性磷酸钠溶解于蒸馏水中，然后加入中性甘
14、油，混匀，分装于灭菌广口瓶中，每瓶 200 mL，121高压灭菌 15 min 备用。 DB34/T 32842018 7 B B 附 录 B （规范性附录） 猪丹毒丝菌荧光定量 PCR 检测结果判定 B.1 结果判定 B.1.1 结果分析条件设定 B.1.1.1 读取检测结果。 B.1.1.2 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根据仪器噪 音情况进行调整。 B.1.2 质控标准 B.1.2.1 空白对照：无 Ct 值并无明显的扩增曲线和溶解曲线。 B.1.2.2 阴性对照：无 Ct 值并无明显的扩增曲线和溶解曲线。 B.1.2.3 阳性对照：Ct 值30
15、并出现特异的扩增曲线和较为一致的溶解曲线。 B.1.3 结果描述及判定 B.1.3.1 阴性反应结果判定：检测结果呈现无 Ct 值并无明显的扩增曲线和溶解曲线，判为荧光 PCR 阴性反应，样品判为猪丹毒丝菌核酸检测阴性。 B.1.3.2 阳性反应结果判定：检测结果呈现 Ct 值30 并出现特异的扩增曲线和较为一致的溶解曲 线，判为荧光 PCR 阳性反应，样品判为猪丹毒丝菌核酸检测阳性。 B.1.3.3 对于 30Ct 值35 的样品，需重新取样进行重复扩增。如果重复测结果的 Ct值35，且出 现特异的扩增曲线和较为一致的溶解曲线，判为阳性反应。否则判为荧光 PCR 阴性反应。 B.1.3.4 必要时，对初次检测呈荧光 PCR 阳性反应的样品进行重复检测。 B.1.3.5 猪丹毒丝菌实时荧光定量 PCR 具体检测结果判定见图B.1。 DB34/T 32842018 8 图B.1 猪丹毒丝菌实时荧光定量 PCR 检测结果 _
