1、ICS 65.020 B 04 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 32932018 农田杂草反枝苋对草甘膦抗性检测 技术规程 Code of practice for detection of glyphosate-resistant redroot pigweed (Amaranthus retroflexus L.) in cropland 文稿版次选择 2018 - 12 - 29 发布 2019 - 01 - 29 实施 安徽省市场监督管理局 发布 DB34/T 32932018 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。 本标准由安徽省农业科学院棉花研
2、究所提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：安徽省农业科学院棉花研究所、中国农业科学院棉花研究所、岳西县农业技术综 合服务中心、六安市植物检疫植物保护站、来安县农业技术推广中心、太湖县种植业管理局、宣城市种 植业管理局、黄山市农业科学研究所、安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所。 本标准主要起草人：李淑英、路献勇、马艳、马小艳、阚画春、程福如、陈敏、刘小玲、郑曙峰、 程森林、王维、徐道青、石扬娟、祁静星、胡俊斌、胡锋、吴明奎、胡本进。 DB34/T 32932018 1 农田杂草反枝苋对草甘膦抗性检测技术规程 1 范围 本标准规定了农田杂草反枝苋（ Amar
3、anthus retroflexus L.）对除草剂草甘膦抗性检测试剂与溶 液、仪器和设备、生物试材、试验步骤、数据统计与分析与抗药性水平的评价。 本标准适用于反枝苋对除草剂草甘膦抗性的检测。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 胚根长度 Lengt h of radicel 从与种子连接处到胚根顶端。 2.2 胚轴长度 Lengt h of hypocotyl 从与种子连接处到胚轴顶端。 3 试剂与溶液 3.1 草甘膦原药。 3.2 莽草酸（Shikimic Acid；3,4,5-三 羟基-1-环己烯-1-羧酸；99纯度）。 3.3 10 Triton X-100（聚乙二醇
4、辛基苯基醚）。 3.4 0.1 Triton X-100。 3.5 0.3高锰酸钾（KMnO 4）。 3.6 0.25 mol/L 盐酸。 3.7 1 mol/L 氢氧化钠。 3.8 0.1 mol/L 甘氨酸（C 2H5NO2）。 3.9 0.1高碘酸（HIO 42H2O）。 4 仪器和设备 4.1 培养皿（内径 9 cm）。 4.2 盆钵。 4.3 移液器（20 L、100 L、200 L、1000 L 和 5000 L）。 4.4 可控定量喷雾设备。 DB34/T 32932018 2 4.5 紫外可见光分光光度计。 4.6 离心管（1.5 mL，2 mL，10 mL）。 4.7 超高速
5、离心机。 4.8 光照培养箱。 4.9 人工气候箱：可设定温度为白天 30黑夜 25、相对湿度（RH）60 10、光照周期 12 h: 12 h（L: D）。 5 生物试材 5.1 试验土壤 采集有机质含量3 g/kg、pH 6.06.5 或 6.57.0 壤土粉碎风干后备用，试验前在 120干燥 箱内烘 6 h（灭活土壤内杂草种子）。 5.2 杂草种子 采集各试验样点成熟的反枝苋种子。种子的田间采集区域不小于 100 m 50 m，每隔 20 km 取样 1 次，然后将每个地区或县域内所取样本混合。同时在没有施用过草甘膦地区采集反枝苋种子，作为敏感 对照。 杂草种子 4低温冰箱中保存。 6
6、试验步骤 6.1 杂草种子处理 首先将供试反枝苋种子用质量分数为 0.3的高锰酸钾溶液浸泡消毒 10 min，用无菌水清洗 3 次。然后在 9 cm 培养皿内放 2 层滤纸，每皿放 入 50 粒反枝苋种子，置于光照培养箱内催芽，培养 周期和温度设为白天 3012 h、黑夜 2512 h，当种子露白时待用 。 6.2 反枝苋幼苗处理 试验土壤定量装至盆钵的 4/5 处。采用盆钵底部渗灌方式，使土壤完全湿润。将预处理的供试反 枝苋种子均匀撒播于土壤表面，覆土 0.51.0 cm 左右，播种后移入人工气候箱常规培养。以盆钵底 部渗灌方式补水。杂草出苗后进行间苗，当反枝苋长至 34 叶期时定苗，每钵保
7、留长势一致的 10 棵 幼苗。 6.3 药液配制 6.3.1 Triton X-100 系列溶液配置 6.3.1.1 30 Triton X-100 量取 30 mL Tri ton X-100，加水定容 到 100 mL。 6.3.1.2 10 Triton X-100 量取 33.33 mL 30 Triton X-100，加水定容至 100 mL。 6.3.1.3 0.1 Triton X-100 DB34/T 32932018 3 量取 1 mL 10 Triton X -100，加水定容到 100 mL。 6.3.2 草甘膦母液配置 准确称取一定量的草甘膦原药，用丙酮溶解，并加入 1
8、0 Triton X-100，配制成母液备用。 6.4 测定方法 测定方法可选择附录A、附录B、附录C 中的任一种，以附录B 中整株植物测定法为宜。 6.5 结果调查 根据不同测定方法，选择如下结果调查方法： 培养皿测定法：在草甘膦处理后 7 d 测量反枝苋胚根和胚轴的长度。 整株植物测定法：在施药后 8 d，记录每个剂量处理的反枝苋药害症状与级别（见表 1），然 后剪取地上部分称量鲜重，再放入干燥箱内，经 7048 h 烘干后称取干重。 莽草酸测定法：根据吸光值，结合莽草酸的标准曲线，计算出不同浓度药剂处理后反枝苋体内 莽草酸的累积量。 表1 草甘膦对反枝苋毒害症状分级标准 级 别 反枝苋药
9、害症状 0 无症状。 1 叶片轻微萎蔫。 2 心叶出现萎蔫现象，叶片开始黄化卷曲，部分叶片出现枯斑，枯叶面积为 2040。 3 呈现黄色或褐色，枯叶面积为 4070，植株生长受到抑制，萎缩趋势明显。 4 叶片畸形卷曲，植株叶片整体褪色枯萎，枯叶面积达到 70以上，植株明显萎蔫，生长停滞。 5 植株萎缩干枯，枯死面积达到 95以上，或整株死亡。 7 数据统计与分析 7.1 除草剂抑制效果计算方法 根据培养皿测定法调查数据，按式（1）计算各药剂处理的胚根长或胚轴长占空白对照的生长百分 率（），计算结果保留小数点后两位。 RL L1 L0 100 . (1) 式中： RL 生长百分率（）； L0 对
10、照反枝苋胚根长（或胚轴长）（mm）； L1 处理反枝苋胚根长（或胚轴长）（mm）。 根据整株植物测定法调查数据， 利用式 （2） 计算施药后反枝苋的药害反应的药害综合指数 I（） 。 i 为杂草药害等级。 I （ Ni i） N imax 100 . (2) 式中： Ni 每钵各毒害级别杂草株数； DB34/T 32932018 4 i 毒害级别； N 每钵总杂草株数； imax 每钵最高毒害级别。 根据调查数据，利用式（3）计算各药剂处理反枝苋的干重占空白对照的干重百分率。 RG G1 G0 100 . (3) 式中： RG 生长百分率（）； G0 对照反枝苋干重（g）； G1 各处理反枝苋
11、干重（g）。 7.2 回归方程和抑制中浓度计算方法 用 DPS（数据处理系统）、SAS（统计分析系统）或 SPSS（社会科学统计程序）标准统计软件按式 （4） 对药剂浓度与生长百分率 RL、 药害综合指数 I 或干重百分率 RG 进行非线性回归分析， 计算 ED50、 ED90 值及 95置信限。 RL（或 I、 RG） C D C 1( x ED50 ) b . (4) 式中： RL 生长百分率； RG 干重百分率； I 药害综合指数； x 草甘膦浓度(mg/L)； C 高浓度草甘膦处理下杂草生长百分率； D 低浓度草甘膦处理下杂草生长百分率； ED50 对杂草生长起到 50抑制作用的草甘膦
12、浓度(mg/L)； b ED50 处的曲线斜率。 用 DPS（数据处理系统）、SAS（统计分析系统）或 SPSS（社会科学统计程序）标准统计软件按式 （5）对药剂浓度与莽草酸积累量进行非线性回归分析，计算 ED50、 ED90 值及 95置信限。 U D C D 1exp( b(log xlog ED50) . (5) 式中： U 草甘膦处理后莽草酸积累量； x 草甘膦浓度(mg/L)； D 当草甘膦浓度为 0 时莽草酸积累量； C 当草甘膦在极高浓度是莽草酸积累量； ED50 当莽草酸积累量达 C 与 D 之间的 50时的草甘膦浓度(mg/L)； b 曲线在 ED50 处的斜率。 8 抗药性
13、水平评价 8.1 抗性倍数的计算 DB34/T 32932018 5 根据敏感杂草生物型的 ED50 值和测试杂草生物型的 ED50 值，按式（6）计算测试种群的抗性倍数。 RR T S . (6) 式中： RR 测试杂草生物型的抗性倍数； T 测试杂草生物型的 ED50 值； S 敏感杂草生物型的 ED50 值。 8.2 抗药性水平的评价 根据抗性倍数的计算结果，按照表2中抗药性水平的分级标准，对测试杂草生物型的抗药性水平作 出评估。 表2 抗药性水平的分级标准 抗药性水平分级 抗性倍数 （倍） 低水平抗性 5.0 RR 10.0 中等水平抗性 10.0 RR 50.0 高水平抗性 RR 5
14、0.0 DB34/T 32932018 6 A A 附 录 A （规范性附录） 培养皿测定法 A.1 将草甘膦母液用 0.1 Triton X-100 水溶液按照等比梯度配制成 57 个系列浓度（0320 m g/L） ；每处理设 6 次重复，并设不含药剂的 Triton 水溶液作空白对照。 A.2 选 20 粒经预处理露白的反枝苋种子均匀摆放 于垫有 2 张滤纸的培养皿（直径 9 cm）内，种子 的胚根与胚芽的方向要保持一致。 A.3 向培养皿内加入 5 mL 系列浓度的草甘膦药液 ，使种子充分浸入药液中；将处理后的培养皿置于 光照培养箱内，在 12 h 光照 30、12 h 黑暗 25的条
15、件下培养。同时保持培养皿内湿润。 DB34/T 32932018 7 B B 附 录 B （规范性附录） 整株植物测定法 B.1 将草甘膦母液用 0.1 Triton X-100 水溶液按照等比梯度配制成 911 个系列浓度 （08960 g ai/ha） ；每处理设 6 次重复，并设不含药剂的处理作空白对照。 B.2 标定喷雾设备参数（喷雾压力和喷头类型） ，校正喷液量；当反枝苋长到 56 叶时，按试验设计 从低剂量到高剂量顺序进行喷雾处理。 B.3 处理后待试材表面药液自然风干，移入人工气候箱常规培养。以盆钵底部渗灌方法补水。 DB34/T 32932018 8 C C 附 录 C （规范
16、性附录） 莽草酸测定法 C.1 反枝苋幼苗的药剂处理方法同整株植物测定法。 C.2 喷药 6 d 后剪取反枝苋植株上部茎叶(倒 2、 倒 3 叶)， 称重后放入液氮中冷冻， 然后再放入80 的冰箱中保存，待样品收集完毕之后，统一进行莽草酸含量的测定。 C.3 首先取叶片(0.45 g1.25 g)加液氮充分研磨，然后按 1 g 新鲜组织加 4 mL 0.2 5 mol/L HCl再 次研磨。 C.4 研磨后放入 10 mL 离心管中平衡后 1000 0 g、4离心 15 min。 C.5 取 200 L 离心上清液加入 2 mL 0.1 高碘酸，于 37温浴 2.53 h，以充分氧化莽草酸；然
17、 后加入 2 mL 1 mol/L NaOH 和 1.2 mL 0 .1 mol/L 甘氨酸充分混匀，终止反应。 C.6 用紫外可见光分光光度计在 380 nm 处测定吸光度。每克新鲜组织的莽 草酸积累量用莽草酸的标 准曲线标定。 C.7 将莽草酸标准样品 10.0 mg 溶于 1.0 mL 0.25 mol/L HCl中，分别从中取 0、1、2.5、5、10、1 2.5、25 L于 1.5 mL 离心管，加 0.25 mol /L HCl 至 1.0 mL。取 200 L 莽草酸稀释液加入 2 mL 0. 1高碘酸，于 37温浴 2.53 h，以充分氧化莽草酸；然后加入 2 m L 1mol/L NaOH 和 1.2 mL 0.1 mol/L 甘氨酸充分混匀，终止反应；于紫外可见光分光光度计 380 nm 处测定吸光度。通过回归分析建 立莽草酸标准曲线方程。 _
