1、ICS 65.020.30 B 45 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 30992018 动物饲料中氟腺嘌呤残留量的测定 HPLC-MS/MS 法 The determination of Fluoroadenine residues in animal feed HPLC-MS/MS method 文稿版次选择 2018 - 04 - 16 发布 2018 - 05 - 16 实施 安徽省质量技术监督局 发布 DB34/T 30992018 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省检验检疫科学技术研究院提出。 本标准由安徽省动植物检验检疫标
2、准化技术委员会归口。 本标准起草单位：安徽省检验检疫科学技术研究院、宣城出入境检验检疫局、安徽省食品药品检验 研究院、六安出入境检验检验局、宣城市农产品质量安全监管局、安徽农业大学。 本标准主要起草人：苏婷婷、郝向东、王务平、纪文、程浩、黄金华、丁磊、王伟、晏苒、曾明华。 DB34/T 30992018 1 动物饲料中氟腺嘌呤残留量的测定 HPLC-MS/MS 法 1 范围 本标准规定了动物饲料中氟腺嘌呤残留量的 HPLC-MS/MS 的测定方法。 本标准适用于动物饲料中氟腺嘌呤残留量的检验。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用
3、于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 方法原理 试样中的氟腺嘌呤残留采用二氯甲烷提取，SPE 柱 Sep-p ak C18 固相萃取小柱净化，HPLC-MS/MS 测定，外标法定量。 4 试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水应符合 GB/T 6682 规定的一级水。 4.1 甲醇：色谱级。 4.2 正己烷：色谱级。 4.3 甲酸：色谱级。 4.4 氨水：含量为 2528。 4.5 二氯甲烷。 4.6 0.1甲酸-甲醇溶液：移取 1.0 mL 甲酸(4.3) ，用甲醇(4.1)稀释并定容
4、至 1000 mL，混匀。 4.7 0.1甲酸-水溶液：移取 1.0 mL 甲酸( 4.3)，用水稀释并定容至 1000 mL，混匀。 4.8 20甲醇溶液：20 mL 甲醇 (4.1) 与 80 mL 水混匀。 4.9 40甲醇溶液：40 mL 甲醇 (4.1) 与 60 mL 水混匀。 4.10 0.5氨水-甲醇溶液：移取 0.5 mL 氨水(4. 4)，用甲醇(4.1)稀释并定容至 100 mL，混匀。 4.11 氮气：纯度 99.999。 4.12 标准品：氟腺嘌呤，纯度 99.2。 4.13 标准储备液 (100 g/mL)：称取 10 mg（精确至 0.1 mg）标准品(4.12)
5、，用适量甲醇超声溶解， 待完全溶解后用甲醇定容至 100 mL，混匀。20 以下避光保存，有效期为 6 个月。 4.14 标准工作液 (1 g/mL)：用甲醇稀释氟腺嘌呤标准储备液至 1 g/mL，4 以下避光保存，有 效期为 3 个月。 DB34/T 30992018 2 5 仪器和设备 5.1 液相色谱-串联四级杆质谱仪：配电喷雾离子源(ESI)。 5.2 分析天平：感量为 0.01 mg 和 0.1 g。 5.3 涡旋混合器。 5.4 离心机：转速 10000 r/min。 5.5 固相萃取装置。 5.6 粉碎机。 5.7 氮吹浓缩仪。 5.8 旋转蒸发仪。 6 试样制备与保存 6.1
6、制样操作过程中应防止动物饲料样品受到污染或发生残留物含量变化。 6.2 将动物饲料放入粉碎机(5.6)中粉碎，装袋置于干燥状态下保存，并标明标记。 7 测定步骤 7.1 提取 称取 2 g (精确至 0.01 g)粉碎后饲料样品于 50 mL 离心管中，加入 10 mL 二氯甲烷(4.5)，涡 旋混匀后超声提取 5 min，再以 10000 r/mi n 离心 5 min，取全部上清液至 50 mL 鸡心瓶中，在样品 残渣中再加入 10 mL 二氯甲烷(4.5) 重复提取一次，合并 2 次提取液于 60下水浴旋转蒸发至近干， 用 5 mL 40甲醇溶液(4.9)溶解残渣，加入 10 mL 正己
7、烷 (4.2)，2000 r/mi n 涡旋混匀 1 min ，静置 5 min，弃去上层正己烷层，留下层清液备用，待净化。 7.2 净化 SPE 柱 Sep-pak C18 分别用 5 mL 甲醇活化，5 mL 水平衡，取全部备用液过柱，控制流速为 1 mL/min，再用 5 mL 水和 5 mL 20甲醇溶液(4.8)以 1 mL/min 速度淋洗柱子，负压抽干，用 5 m L 5 氨水甲醇溶液(4.10)洗脱，收集全部洗脱液。洗脱液于 40下氮气吹干。残渣用 1 mL 甲醇(4.1)溶解， 过 0.22 m 的有机滤膜，供液相色谱串联质谱仪测定。 7.3 测定 7.3.1 液相色谱参考条
8、件 液相色谱条件如下： a) 色谱柱：Luna C18（2）柱（5 m，150 mm 2.00 mm）； b) 流动相： 流动相 A 为 0.1甲酸-甲醇溶液；流动相 B 为 0.1甲酸水溶液； 等度洗脱程序： 流动相 A： 流动相 B 为 80:20（v/v）； c) 流速：200 L/min； d) 柱温：40； DB34/T 30992018 3 e) 进样量：5 L。 7.3.2 质谱参考条件 质谱条件如下： a) 离子化模式：电喷雾电离（ESI)，正离子模式； b) 扫描方式：多反应监测（MRM)； c) 分辨率：单位质量分辨率； d) 其他质谱条件参见附录 A； e) 使用前应调节
9、各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求；详细条件参见附录 A； f) 毛细管电压、雾化气压力、气帘气压力、辅助气流速、碎裂电压（FP）、碰撞气能量（CE）等 参数应优化至最优灵敏度，参考条件和定性离子对、定量离子见附录 A。 7.3.3 定量测定 取空白样品按照 7.1-7.2 处理，配制适用浓度 的基质匹配标准工作液(4.13)，按浓度由低到高进 样检测，以定量子离子峰面积-浓度作图，得到基质匹配标准曲线。在上述色谱条件下，氟腺嘌呤参考 保留时间为 2.2 min。其色谱行为见附录B。 待测样液中待测分析物的响应值应在标准曲线线性范围内， 超过线性范围则应稀释至相应范围内再 进样分析。 7.3
10、.4 定性确证 在相同实验条件下， 试样中待测物质的保留时间与标准工作溶液中对应的标准物质保留时间偏差在 2.5之内；在试样谱图中所选择的待测物离子对均出现，且相对丰度与标准工作溶液中定性离子的 相对丰度允许偏差不超过表1 规定的范围时，则可确定为样品中存在相应的目标化合物。 表1 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 50 2050 1020 10 允许的相对偏差 20 25 30 50 8 空白试验 除不加试样外，均按上述步骤进行。 9 结果计算 见公式（1）。 . (1) 式中： X 试样中氟腺嘌呤的残留量，单位为微克每千克（ g/kg）； M 试样的体积或质量，单位为克（
11、g）； V 样品溶液最终定容体积，单位为毫升（mL）； CS 从标准曲线得到的待测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升（ng/ml）。 S CV X M DB34/T 30992018 4 10 定量限和精密度 10.1 定量限 本标准中氟腺嘌呤定量为 0.6 g/kg。 10.2 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 20。 DB34/T 30992018 5 A A 附 录 A （资料性附录） 液相色谱-串联质谱仪器参数参考条件 液相色谱-串联质谱仪器参数参考条件如下： a) 电喷雾电压：5500 V； b) 离子化温度：500； c) 气帘气流速：50.0
12、 L/min； d) 雾化气流速：50.0 L/min； e) 辅助气流速：50.0 L/min； f) 聚焦电压：400 V； g) 碰撞室射出电压：13 V； h) 碰撞气：氮气； i) 其他质谱分析参数见表 A.1。 表A.1 主要参考质谱参数 化合物 母离子 （m/z） 子离子 （m/z） 保留时间 /min 去簇电压 /V 碰撞能量 /eV 氟腺嘌呤 278.0 142.9 a 2.2 35 32 106.9 45 a 定量离子。 注： 对于不同质谱仪器，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳。 DB34/T 30992018 6 B B 附 录 B （资料性附录） 氟腺嘌呤标准物质的多反应监测（MRM）色谱图 图B.1 278.0-142.9 监测离子色谱图 图B.2 278.0-106.9 监测离子色谱图 _
