1、ICS 67.040 X 00 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 30852018 浓香大曲检测操作规程 Discipline for the detect of Luzhou - flavor Daqu 文稿版次选择 2018 - 04 - 16 发布 2018 - 05 - 16 实施 安徽省质量技术监督局 发布 DB34/T 30852018 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽白酒标准化技术委员会提出并归口。 本标准起草单位：安徽文王酿酒股份有限公司、安徽国科检验检测有限公司、安徽瑞思威尔科技有 限公司、国家农副加工食品质量监督检验
2、中心、天津科技大学。 本标准主要起草人：崔磊、邵栋梁、张居舟、董思文、蒋超、芮友涛、杨恩贺、肖冬光、郭学武、 席鲜会、马珂珂、吴再节、冯志成、崔战友、李清晨、常强、高亚利、杨昆鹏。 DB34/T 30852018 1 浓香大曲检测操作规程 1 范围 本标准规定了浓香大曲的术语和定义、试剂与仪器、抽样、感官、制样与理化分析操作规程。 本标准适用于浓香大曲产品检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 601 化学试剂 标准滴定溶液的制备 GB
3、/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 QB/T 4257 酿酒大曲通用分析方法 QB/T 4259 浓香大曲 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 发酵力单位 liquerying power unit 在 30，1 g 曲利用可发酵糖产生二氧化碳的克数，符号为 U，以(g/g）表示。 3.2 蛋白酶活力单位 protease a ctivity unit 1 g 干曲，在 40，一定 pH 条件下，1 min 水解酪蛋白生成酪氨酸的微克数为 1 个酶活力单位 （U），以微克每克分钟（ug/gmin）表示。 4 抽样 4.1 抽样方式 以裸露在外的五个点随机抽取。 4.
4、2 抽样数量 抽样数量参照标准 QB/T 4259 浓香大曲中规定执行。 5 感官检验 DB34/T 30852018 2 5.1 外观 在适宜光线(非直射阳光)下，从大曲 6 个面立体观察曲坯表面菌丝的颜色、挂衣、裂缝及光洁度 等外表特征，并进行记录。 5.2 断面 将曲块断开，观察界面上菌丝形态、颜色、菌斑、泡气等情况，以及有无青霉、黄曲霉和窝水情况 等并进行特征记录。 5.3 曲皮厚 对曲块表层未发酵的生淀粉及菌丝不密集部分的厚度(并非水圈以外的部分)进行观测和记录。 5.4 曲香 嗅闻大曲断面散发出来的香气，分辨是否纯正、有无复合曲香，检查有无氨味、霉味等异杂味等， 并进行记录。 6
5、试剂与仪器 6.1 实验用水 本标准中所用水，在未注明其他要求时，均指符合 GB/T 6682 中三级及以上要求。 6.2 试剂 本标准中所用试剂，在未注明特殊要求时，均指分析纯(AR)。 6.3 分析天平 感量为 0.0001 g。 6.4 电热干燥箱 精度 2。 6.5 电炉 1000-2000 瓦可调电炉 6.6 分光光度计 756 紫外可见分光光度计 6.7 水浴锅 精度 2 7 理化分析 7.1 制样 DB34/T 30852018 3 将抽取的大曲样品用粉碎机粉碎，过 40 目塞后充分搅拌均匀，置于干燥处备用。 7.2 水分 7.2.1 恒重法 参照 QB/T 4257 的规定执行
6、。 7.2.2 定时恒温烘干法 称取粉碎均匀的大曲试样置于 1302下烘干 40 分钟，根据烘干前后质量之差，计算出所失去 的质量分数，即为水分含量。 取洁净称量瓶置于 1352电热干燥箱中，瓶盖斜支于瓶 边，加热 30 分钟，取出盖好，置干燥 器内冷却 20 min ，称量。用烘干的称量瓶称取大曲试样 4 g5 g ，精确至 0.0001 g，置于 1352 电热干燥箱中，然后将烘箱温度调至 130烘 40 分钟(烘干时打开瓶盖，侧立于该瓶边)。取出，迅速 移入干燥器内(盖上瓶盖)冷却 20 min，称量。 7.2.3 结果计算 水分含量测定见公式（1）。 %100)()( 121 1 mm
7、mmX . (1) 式中： X1 试样的水分含量，单位为克每百克（g/100g）； m1 烘干前，称量瓶加试样的质量，单位为克(g)； m2 烘干后，称量瓶加试样的质量，单位为克(g)； m 恒重称量瓶的质量，单位为克(g)。 注： 计算结果保留至小数点后一位。 7.2.4 精密度 在重复性条件下，获得两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 5。 7.2.5 注意事项 水分应在专用电热干燥箱中烘干，不宜采用电热丝或电热灯进行烘干，以免影响实验准确度。 7.3 酸度 7.3.1 方法摘要 采用酸碱中和，酚酞在碱性环境下显红色，测定大曲试样的酸度。 7.3.2 试剂与仪器 0.1 mol/
8、L 氢氧化钠标准溶液：按 GB/T 601 配制与标定； 酸度计：精度 0.02； 烧杯：500 ml、100 ml； 碱式滴定管：10 ml。 7.3.3 分析步骤 DB34/T 30852018 4 7.3.3.1 样液的制备 称取以绝干计大曲试样 10 g，精确至 0.01 g，放入 500 mL 烧杯中，加无二氧化碳水 200 mL， 用玻璃棒搅拌 0.5 min， 浸泡 30 min(每隔 5 min 搅拌一次)后，用滤布过滤，收集滤液，备用。 7.3.3.2 电位滴定法 参照 QB/T 4257-201 2 中 5.3 的规定执行。 7.3.3.3 指示剂法 吸取样液 2.0 mL
9、 于 250 mL 三角烧瓶中，加无二氧化碳水 50 mL，摇匀，以酚酞为指示剂，用 0.1 mol/L 氢氧化钠滴定至终点。 记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积 V 1，以水作空白，同样操作进行空白试验，记录消耗氢氧化钠 标准溶液的体积 v 0。 7.3.3.4 结果计算 酸度测定见公式（2）。 %100 2 200)(c 01 vv X . (2) 式中： X 试样的酸度（以绝干计）即每 10 克曲消耗 0.1 mol/L 氢氧化钠毫摩尔数，单位毫摩尔每 10 克（mmol/10g）, c 氢氧化钠标准溶液的浓度，单位为摩尔每升(mol/L)： v1 滴定试样时，消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单
10、位为毫升(mL)； v0 空白试验时，消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单位为毫升(mL); 20 取样液进行滴定的体积，单位为毫升(mL)； 2 取样液进行滴定的体积，单位为毫升(mL)； 注： 计算结果保留至小数点后一位。 7.3.4 精密度 在重复性条件下，获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 5。 7.4 淀粉含量 7.4.1 方法摘要 淀粉分子在盐酸作用下，被水解生成还原糖。 利用斐林溶液与还原糖共沸，生成氧化亚铜沉淀，用次甲基蓝作指示剂，以水解后的样液滴定费林 溶液，达到终点时，稍微过量的还原糖使次甲基蓝的蓝色消失，以示终点。根据生成的还原糖量折算出 淀粉含量。 7.4.
11、2 方法一 按照 QB/T 4257 的规定执行。 7.4.3 方法二 DB34/T 30852018 5 7.4.3.1 试剂与仪器 如下： a) 盐酸溶液：量取 200 mL 盐酸，与 800 mL 水混合。 b) 氢氧化钠溶液：称取 200 g 氢氧化钠，加适量水溶解，待冷却后定容至 1000 mL。 c) 1 g/L 葡萄糖标准溶液：准确称取预先在 1051烘干的 无水葡萄糖 1 g (准确 0.0002 g), 溶解于水，加 5 mL 浓盐酸，用水定容至 1 L。 d) 碘液 1) 原碘液：称取碘 11 g、碘化钾 22 g，用少量水研磨溶解，用水定容至 500 mL，贮于棕色 瓶中
12、。 2) 稀碘液：吸取 2 mL 原碘液，加碘化钾 20 g，用水定容至 500 mL，贮于棕色瓶中。 e) 斐林溶液 1) 配制 甲液：称取 15 g 硫酸铜（CuSO 45H2O）、0.05 g 亚甲基蓝，溶解于水并稀释至 1 L。 乙液：称取 50 g 酒石酸钾钠、54 g 氢氧化钠、4 g亚铁氰化钾，溶于水并稀释至 1 L。 2) 标定 预备试验：吸取斐林甲、乙液各 5 mL 于150 mL锥形瓶中，加 10 mL 水，摇匀，在电炉上 加热至沸腾，在沸腾状态下用制备好的葡萄糖标准溶液滴定，当溶液的蓝色将消失，部分 溶液变黄时，判定为终点，记录消耗葡萄糖标准溶液的体积。 正式试验：吸取斐
13、林甲、乙液各 5 mL 于150 mL锥形瓶中，加 10 mL 水和比预备试验少 l mL 的葡萄糖标准溶液，摇匀，在电炉上加热至沸腾，在沸腾状态下于 1 min 内以 2 s 一 滴的速度用葡萄糖标准溶液滴定至终点，记录消耗葡萄糖标准溶液的总积 V 0。 f) 酸碱滴定管：量程 50 mL，精确度 0.01 mL。 7.4.3.2 试样溶液的制备 曲粉原滤液：称取曲粉 2 g，精确至 0.001 g，放 2 50 mL 锥形瓶中，加入 100 mL 盐酸溶液，装 上回流冷凝管，加热煮沸 2 h，取下立即冷却，用稀碘液检查水解是否完全，若未完全水解，则延长反 应时问直至完全水解，完全水解后，用
14、氢氧化钠溶液中和至微酸性，将全部滤液和残渣用水过滤并定容 至 1000 mL。 7.4.3.3 滴定 如下： a) 预备试验：吸取斐林甲、乙液各 5 mL 于 150 mL 锥形瓶中，摇匀，加 10 mL 水，用滴定管加 入样液 5 mL，摇匀后，置于电炉上加热至沸腾 ，用葡萄糖滴定直至溶液出现黄色为终点，记 录消耗试样溶液的体积。 b) 正式试验：吸取费林甲、乙液各 5.0 mL于 150 mL 锥形瓶中，摇匀，加 10 mL 水以及 5 ml 样 液，再用滴定管加入比预备试验少 l mL 的葡萄糖，摇匀，在沸腾状态下于 1 min 内以 2 s 一滴的速度继续用葡萄糖滴定，直至黄色出现为终
15、点，记录消耗样液的总体积 V。 7.4.3.4 结果计算 淀粉含量 测定见公式（3）。 DB34/T 30852018 6 100.90 m 1 1000 5 1 cV-V0 X . (3) 式中： X 试样的淀粉含量，单位为克每百克（g/100g） V0 标定斐林液消耗葡萄糖标准溶液的体积，单位为毫升（mL）； V 加试样正式滴定时斐林液消耗葡萄糖标准溶液的体积，单位为毫升（mL）； c 葡萄糖标准溶液浓度，单位为克每毫升（g/mL）； 5 滴定时加入稀释试样体积，单位为毫升（mL）； 1000 稀释试样总体积，单位为毫升（mL）； 0.9 还原糖换算成淀粉的系数； m 大曲质量，单位为克（
16、g）。 7.4.3.5 精密度 在重复性条件下，获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10。 7.4.3.6 注意事项 氢氧化钠溶液中和盐酸溶液时，溶液 pH 尽量维持在 7.0 左右。 实验要有平行组，以保障结果准确性。 7.5 液化力 按 QB/T 4257 的规定执行。 7.6 发酵力测定 7.6.1 方法摘要 大曲是糖化发酵剂。 其中的酵母能使酒醅中还原糖发酵，生成酒精和二氧化碳，所以可使用在一定条件下制备的糖化液 为培养基，测定发酵过程中生成的二氧化碳的量，来衡量大曲的发酵力。 7.6.2 方法一 按照 QB/T 4257 的规定执行。 7.6.3 方法二 7.6.3
17、.1 试剂与仪器 如下： 发酵瓶：250 mL 三角瓶，带发酵栓； 培养箱：精度 1； 2.5 moL/L 硫酸溶液：取 28 mL 浓硫酸，边搅拌边缓慢加入 100 mL 水中，最后用水稀释至 200 mL。 7.6.3.2 糖化液的制备 DB34/T 30852018 7 称取高粱 200 g，加水 1000 mL，混匀加液化酶（5 u/g 原料），90水浴锅中水浴 1 h，再在灭 菌锅中 121 15 min 蒸煮，取出后冷却至 60，加糖化 酶（50 u/g 原料），糖化 34 h，用稀碘 液试之不显蓝色，过滤后加水至糖度为 7 B。 将上述糖化液分别取 150 mL 于 250 mL
18、 发酵瓶中，塞上棉塞并包上牛皮纸，记录液面高度。同时 用牛皮纸包好发酵栓，一起放入灭菌锅中灭菌 15 min。 7.6.3.3 发酵力的测定 灭菌后的糖液冷却到 28左右，在无菌条件下 ，加入曲粉 1 g，空白实验不加入曲粉。发酵栓中 加入 10 mL 2.5 moL /L 硫酸溶液，用凡士林密封发酵瓶，擦干瓶外壁 ，在感量为 0.0001 的分析天平 上称重，然后放入 30保温箱中发酵。期间每隔 24 h 取出摇晃排出气体，称重，直至发酵瓶恒重发 酵结束。 发酵力为每 1 克曲发酵完全后产生二氧化碳的克数(gco 2/g 曲）。 7.6.3.4 结果计算 液化力测定见公式（4）。 发酵力 4
19、-32-1 mm-mmX . (4) 式中： X 发酵力，单位为克每克（g/g）； m2 试验组发酵前发酵瓶总质量，单位为克（g）； m1 试验组发酵后发酵瓶总质量，单位为克（g）； m4 空白组发酵前发酵瓶总质量，单位为克（g）； m3 空白组发酵后发酵瓶总质量，单位为克（g）。 7.6.3.5 精密度 在重复性条件下，获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10。 7.6.3.6 注意事项 如下： a) 糖化液浓度要严格控制为 7 B； b) 发酵温度、时间要准确； c) 准备实验的环境温度与发酵温度的温差不宜过大，以免造成硫酸溶液倒吸现象，影响发酵； d) 因使用大曲量较少
20、，尽量使用粉末状大曲。 7.7 糖化力 7.7.1 方法摘要 大曲中的糖化型淀粉酶能将淀粉水解生成葡萄糖。 试样在规定条件下从淀粉的非还原性末端开始依次水解 -1，4糖苷键产生葡萄糖，用费林法测定 所生成的葡萄糖量，以此来表示糖化力。 7.7.2 方法一 糖化力小于 800 的按照 QB/T 4257 的规定执行。 DB34/T 30852018 8 7.7.3 方法二 7.7.3.1 试剂与仪器 如下： a) 恒温水浴锅：精度 0.2。 b) 甲液：称取 6928 g 硫酸铜(CuS0 4 5H20)，用水溶解并稀释至 1000 mL； c) 乙液：称取 346 g 酒石酸钾钠，100 g氢
21、氧化钠，用水溶解并稀释至 1000 mL，摇匀，过滤备 用。 d) 乙酸一乙酸钠缓冲溶液(pH=4.6)：称取 164 g 无水乙酸钠(CH 3COONa)，溶解于水，加 114 mL 冰乙酸，用水稀释至 1000 mL。缓冲溶液的 pH 应以酸度计校正。 e) 可溶性淀粉溶液(30 gL)：称取100105干燥 2 h 的可溶性淀粉 3.0 g，精确至 O.001 g，用水调成糊状，不断搅拌注入 70 mL 沸水，搅拌煮沸 2 min 直至完全透明，冷却至室温， 完全转移至 100 mL 容量瓶中并定容。此溶液现配现用。 f) 葡萄糖标准溶液(2.5 gL)： 称取经 1052烘干至恒重的无
22、水葡萄糖 2.5 g， 精确至 O.0001 g，用水溶解，再加 2 ml浓盐酸，定容至 1000 mL。 g) 氢氧化钠溶液(质量分数为 20)。 7.7.3.2 大曲样液的制备 根据测得大曲试样的水分，称取相当于绝干试样量 5 g，精确至 0.001 g，放入 250 mL 烧杯中， 加 20 mL 乙酸-乙酸钠缓 冲溶液，再加水（180-5水分）ml，用玻璃棒搅拌均匀。 将上述烧杯置于 35恒温水浴中保温浸渍 1 h，过滤，收集滤液，备用。 7.7.3.3 测定 空白：于试管内加入 25.0 mL 可溶性淀粉溶液，再加 5.0 mL 大曲样液，摇匀，加入 20NaOH 溶液 l mL 后
23、，吸取 5.0 mL 作为空白溶液，用葡萄糖标准溶液滴定，记录其消耗体积 V 1。 预备试验：于另一试管内加入 25.0 mL 可溶性淀粉溶液，再加 5.0 mL 大曲样液，摇匀，置于 35 恒温水浴中，准确计时，糖化 l h，加入 20NaOH 溶液 l mL 后，吸取糖化液 5.0 mL 于盛有费林溶 液甲、乙液各 5.0 mL 的锥形瓶中，加水 10 mL，用葡萄糖标准溶液滴定，记录消耗体积。 正式滴定：吸取费林甲、乙液各 5.0 mL 于 150 mL 锥形瓶中，摇匀，加 10 mL 水，糖化液 5 mL， 再用滴定管加入比预备试验少 l mL 的葡萄糖，摇匀，在沸腾状态下于 1 mi
24、n 内以 2 s 一滴的速度继 续用葡萄糖滴定，直终点，记录消耗样液的总体积 V 1。 7.7.3.4 结果计算 糖化力测定见公式（5）。 5125.0 305.2)( 21 VV X . (5) 式中： X 试样的糖化力，单位为毫克每克小时（mg/gh）； V1 滴定空白时，消耗葡萄糖标准溶液的体积，单位为毫升(mL)； V2 滴定试样时，消耗葡萄糖标准溶液的体积，单位为毫升(mL)； 2.5 每毫升葡萄糖标准溶液中含有葡萄糖的质量，单位为毫克(mg)； 30 糖化混合液(可溶性淀粉溶液加大曲样液)的总体积，单位为毫升(mL)； DB34/T 30852018 9 0.125 5 mL 大曲
25、样液相当大曲的质量，单位为克(g)； 5 滴定时吸取的糖化液体积，单位为毫升(mL)。 注1： 计算结果保留至整数。 注2： 若样品糖化力过高，则适当提高淀粉浓度，同时降低大曲浸泡液浓度。 7.7.3.5 精密度 在重复性条件下，获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10。 7.8 酯化力 7.8.1 方法摘要 酯化酶是脂肪酶和酯酶的统称，它与短碳链香脂的生物合成有关。 白酒香味是以酯香为主的复合体，白酒酿造过程中酯化酶的作用是使一个酸元和一个醇元结合、脱 水而生成酯。 酯化是可逆反应，酯酶既能产酯，也能使酯分解。特别在不适宜的酯化条件下（如温度、pH、空气 量等），会将已生成
26、的酯迅速分解。因而要选育产酯能力强，酯分解能力相对较弱的菌株，才能使白酒 中留存较多的酯类。 酯化力是以 1 g 干曲在 35反应 100 h 所产生的己酸乙酯的毫克（mg）数表示。 7.8.2 仪器与试剂 如下： a) 微量滴定管； b) 玻璃蒸馏器：1000 mL； c) 安捷伦气相色谱仪。 d) 己酸(分析纯)。 e) 无水乙醇。 f) 乙醇溶液(体积分数为 30)：量取 300 mL 无水乙醇于 1000 mL 容量瓶中，用蒸馏水定容。 g) 氢氧化钠标准溶液(0.1 molL)：按 GB/T 601 配制与标定。 h) 硫酸标准滴定溶液c( 2 1 H2SO4)=0.1molL：按
27、GB/T 601 配制与标定。 7.8.3 测定步骤 7.8.3.1 酯化样品的制备 吸取 1 mL 己酸于 250 mL 锥形瓶中，加 25 mL 无水乙醇，稍微振荡后，加入 75 mL 蒸馏水，充 分混匀。再称取相当于绝干试样量 15 g，精确至 0.01 g，加到锥形瓶中，摇匀后，塞上塞子，35恒 温箱内保温酯化 7 d，同时做空白试验。 7.8.3.2 蒸馏 将酯化 7 d 后的试样溶液全部移入 250 mL 蒸馏瓶中，量取 50 mL 乙醇溶液分数次充分洗涤锥形 瓶，洗液也一并倒入蒸馏烧瓶中，用 50 mL 容 量瓶接收馏出液(外用冰水浴) ，缓缓加热蒸馏，当收集 馏出液接近刻线时，
28、取下容量瓶，调液温 20，用水定容，混匀，备用。 7.8.3.3 皂化、滴定 DB34/T 30852018 10 将上述馏出液倒入 250 mL 具塞锥形瓶中，加两滴酚酞，以氢氧化钠标准溶液中和(切勿过量)，记 录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。再准确加入 25.0 mL 氢氧化钠标准溶液，摇匀，装上冷凝管，于沸 水浴上回流 0.5 h，取下，冷却至室温。然后，用硫酸标准溶液进行反滴定，微红色刚好消失为其终点， 记录消耗硫酸标准溶液的体积 V 1。 注： 滴定后，可将酒样过滤处理后，经气相色谱仪分析。滴定总酸总酯，结合气相的单项酯和酸分析，使实验结果 更加准确。 7.8.4 结果计算 a) 试样
29、总酯含量(以己酸乙酯计)计，见公式（7）。 1000144.0 50 )25( 11 1 Vcc A . (6) 式中： 01 AAA . (7) 式中： A1 测定总酯含量(以己酸乙酯计)，单位为克每升(g/L)； c 氢氧化钠标准溶液的浓度，单位为摩尔每升(mol/L)； 25.0 皂化时，加入 0.1 mol/ L 氢氧化钠标准溶液的体积，单位为毫升(mL)； c1 硫酸标准滴定溶液的浓度，单位为摩尔每升(mol/L)； V1 滴定时，消耗 0.1 molL 硫酸标准溶液的体积，单位为毫升(mL)； 0.144 与 1 mL 氢氧化钠标准溶液 c(NaOH)=1.000 mol/L相当的
30、以克表示的己酸乙酯的质 量； 25 样品体积，单位为毫升(mL)； A 试样总酯含量(以己酸乙酯计)，单位为克每升(g/L)； A1 未扣除空白试样所测总酯含量(以己酸乙酯计)，单位为克每升(g/L)； A0 空白试验所测总酯含量(以己酸乙酯计)，单位为克每升(g/L)。 b) 试样的酯化力按公式（8）计算。 3 10 50 AX . (8) 式中： X 试样的酯化力(以己酸乙酯计)，单位为 U； A 馏出液的总酯，单位为克每升(g/L)； 50 取样体积，单位为毫升(mL)； 3 10 大曲重量转化系数。 注： 计算结果保留至整数。 7.8.5 精密度 在重复性条件下，获得的两次独立测定结果
31、的绝对差值不得超过算术平均值的 10。 7.8.6 注意事项 DB34/T 30852018 11 如下： a) 酯化温度与时间对结果影响较大，应严格控制。 b) 酯化液倒入蒸馏瓶时，应避免抛洒，三角瓶应用 30乙醇充分洗涤。 c) 蒸馏时，尽量不用旋蒸仪等仪器，以免造成酒中易挥发物质的损失。 d) 蒸馏时出现焦糊现象，可加入适量蒸馏水。 7.9 容重 按照 QB/T 4257 的规定执行。 7.10 酸性蛋白酶活力 7.10.1 方法摘要 在测定蛋白酶活力时，以酪蛋白为底物，蛋白酶将酪蛋白水解，生成含酚基的酪氨酸，在酸性条件 下使福林-酚试剂还原产生蓝色（钼 蓝和钨蓝的混合物），用分光光度计
32、测定即 1 g 干曲，在 40， 一定 pH 条件下，1 min 水解酪蛋白生成酪氨酸的微克数单位（U/g）。 7.10.2 试剂与仪器 如下： a) 标准比色管：25 mL, 0.2 mL b) 分光光度计：可见光分光光度计 c) 水浴锅： 2 d) 福林-酚试剂 e) 0.4 mol/L 碳酸钠溶液：取 42.4 g 碳酸钠，溶于水并稀释至 1 L。 f) 0.4 mol/L 三氯乙酸溶液：取 65.5 g三氯乙酸，溶于水并稀释至 1 L。 g) 10 g/L 酪蛋白溶液：取 1 g 酪蛋白（准确至 0.001 g）于 100 mL 容量瓶中，先加入约 0.5 mL 乳酸再加入 pH=3.
33、0 的乳酸缓冲液，沸水浴中加热溶解，冷却后，用 0.1 mol/L 的盐酸溶液或 0.5 mol/L 的氢氧化钠溶液调至 pH=3 .0，最后用乳酸缓冲液稀释定容至 100 mL，储存于冰箱 中备用，有效期 3 d。 h) 标准 L-酪氨酸溶液：准确称取 105干燥过的 L-酪氨酸 0.1000 g，加 60 mL 1 mol/L 盐酸溶 液，在水浴中加热溶解，用水定容至 100 mL，浓度为 1 mg/mL 。再用 0.1 mol/L 盐酸溶液稀 释 10 倍，即为 100 g/mL 标准溶液。 i) 乳酸-乳酸钠溶液（pH=3.0） 1) a 液：取8090的乳酸 10.6 g，用水稀释至
34、 1 L； 2) b 液：取纯度为 70的乳酸钠 16 g，用水溶解，并稀释至 1 L。 吸取上述 a 液 8 mL，b 液 1 mL，混匀并用水稀释 1 倍，即为 0.05 m ol/L 乳酸-乳酸钠溶液。 注： 缓冲液配置好后，均用 pH 计校正。 7.10.3 测定步骤 如下： a) 标准曲线的绘制： 取8支 25 mL 试管，分别吸取 100 g/mL 标准酪氨酸溶液 0、1、2、3、4、 5、6、7 mL，分别补水至 10 mL。 吸取稀释后的标准液各 1 mL，分别放在另外 8支试管中，加入 5 mL 0.4 mol/L 碳酸钠溶液 和 1 mL 福林-酚试剂。在40水浴中加热 2
35、0 min显色，在 680 nm 波长下，1 cm 比色皿，以 DB34/T 30852018 12 不含酪氨酸的 “0”试管为空白，测定吸光度，绘制浓度为吸光度的标准曲线。在曲线上查的吸 光度为 1 时对应酪氨酸的微克数，即为吸光常数 k 值，该 k 值应为 95100 范围内，可作 为常数用于试样计算。但若更换仪器或新配置显色剂，则应重测 k 值。 b) 5酶浸出液（酸性酶） 取相当于绝干曲 10 g 的试样（准确至 0.01 g），加 200 mL pH=3.0 的乳酸缓冲液，在 40水浴中浸出 30 min。根据酶活力高低，必要时可再用缓冲液稀释一定 倍数，使吸光度的测定值在 0.20
36、.4 范围内。用干滤纸过滤，得到酶浸出液。 试样测定 吸取酶浸出液 1 mL，注入 10 mL 离心管中（一式三份），在 40水浴中预热 5 min，准确 加入 10 g/L 酪蛋白溶液 1 mL，计时，准确保温 10 m in，立刻加入 2 mL 0.4 mol/L 三氯乙 酸溶液，以沉淀多余蛋白质，终止酶解反应。15 m in 后离心分离，吸取上层清液 1 mL 注入 试管中，加入 5 mL 0.4 mol/L 碳酸钠溶液和 1 mL 福林-酚试剂，摇匀，在 40水浴中加热 显色 20 min。 空白试验 与试样测定同时进行， 离心管中先后注入酶浸出液 1 mL， 三氯乙酸 2 mL， 1
37、0 g/L 酪蛋白 1 mL。 15 min 后离心分离或过滤，以下的操作均与试样测定相同。 以空白液为对照，在 680 nm 波长下，1 cm 比色皿测定式样的吸光度。 7.10.4 结果计算 蛋白酶活力计算见公式（9）。 m AKX 1 10 1 2004 . (9) 式中： X 蛋白酶活力，单位为微克每分钟（ug/min） K 吸光度为1时相当于酪氨酸微克数（吸光常数）； A 式样吸光度； m 干曲质量，单位为克（g）； 200 酶浸出液总体积，单位为毫升（mL）； 4 酶反应液总体积，单位为毫升（mL）； 10 反应时间，单位为分钟（min）。 7.10.5 精密度 在重复性条件下，获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10。 7.10.6 注意事项 如下： a) 标准曲线线性关系 R2 应 0.99，否则应重新制作。缓冲液重新配置使用以及更换分光光度计 时，需重新制作标曲。 b) 各步骤所加溶液应严格控制在规定的时间内，且溶液添加量也要准确。 _
