1、ICS 11.220 B 41 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 29972017 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌检验操作规程 Protocol of examination for Actinobacillus pleuropneumoniae 文稿版次选择 2017 - 12 - 30 发布 2018 - 01 - 30 实施 安徽省质量技术监督局 发布 DB34/T 29972017 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽农业大学、安徽浩翔农牧有限公司提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：安徽农业大学、安徽浩翔农牧
2、有限公司、安徽杜洛克种猪育种有限责任公司、颍 上庆丰农牧发展有限公司。 本标准主要起草人：孙裴、李郁、高亚飞、黄晓慧、崔文竹、魏建忠、殷宗俊、赵顾、张晓东、王 希春。 DB34/T 29972017 1 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌检验操作规程 1 范围 本标准规定了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的检验的设备和材料、检验程序、操作步骤、与副猪嗜血 杆菌鉴别、结果报告。 本标准适用于猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的检验。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 47
3、89.28 食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求 GB 14922.2 实验动物 微生物学等级及监测 NY/T 537 猪放线杆菌胸膜肺炎诊断技术 SN/T 1447 猪传染性胸膜肺炎检疫技术规范 3 主要设备和材料 3.1 显微镜：物镜 10 倍100 倍。 3.2 电子天平：感量 0.1 g。 3.3 恒温培养箱 3.4 冰箱：25，-20。 3.5 无菌培养皿：直径 90 mm。 3.6 无菌试管：15 mm 150 mm。 3.7 无菌锥形瓶：容量 250 mL ，500 mL。 3.8 pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。 3.9 鸡表皮葡萄球菌、金黄色
4、葡萄球菌。 3.10 灭菌棉拭子。 3.11 革兰氏染色液：按照 GB 4789.28 的规定执行。 3.12 鲜血平板培养基：制备方法见附录 A 中 A.1。 3.13 营养琼脂培养基：按照 GB 4789.28 的规定执行。 3.14 尿素琼脂培养基：按照 GB 4789.28 的规定执行。 3.15 改良 TSB 肉汤培养基：制备方法见附录 A 中 A.2。 3.16 改良 TSA 培养基：制备方法见附录 A 中 A.3。 3.17 巧克力琼脂培养基(CA)：制备方法见附录 A 中 A.4。 3.18 改良 PPLO 琼脂培养基(mPPLO)：制备方法见附录 A 中 A.5。 3.19
5、糖发酵培养基：按照 GB 4789.28 的规定执行。 3.20 ONPG 培养基：按照 GB 4789.28 的规定执行。 DB34/T 29972017 2 3.21 缓冲葡萄糖蛋白胨水：按照 GB 4789.28 的规定执行。 3.22 蛋白胨水：按照 GB 4789.28 的规定执行。 3.23 硫酸亚铁琼脂：按照 GB 4789.28 的规定执行。 3.24 硝酸盐培养基与硝酸盐还原试剂：按照 GB 4789.28 的规定执行。 3.25 氧化酶试剂：按照 GB 4789.28 的规定执行。 3.26 Rustigian 氏尿素培养液：按照 GB 4789.28 的规定执行。 3.2
6、7 无菌 PBS 溶液：制备方法见附录 A 中 A.6。 4 检验程序 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌检验操作程序见图1。 图1 猪传染性胸膜肺炎防线杆菌检验操作程序 5 操作步骤 5.1 采样、运输和保存 5.1.1 病料的采集标准 应符合 SN/T 1447 的相关规定。 DB34/T 29972017 3 5.1.2 活体样品采集 用无菌棉拭子伸入鼻腔采集分泌物，放人无菌试管中立即送往实验室供分离。 5.1.3 组织样品的采集 无菌采集具有典型病变的肺脏、肺门淋巴结、扁桃体等器官和鼻腔分泌物，并在死亡 2 h 内完成。 5.1.4 血样的采集制备 无菌操作采集动物血，每头不少于 10 mL。自
7、然凝固后无菌分离血清，分装，加盖密封后 48 保存。 5.1.5 样品运送 采集的样品，均应在 48条件下 24 h 内 送到实验室。脏器组织样品采集后延迟送检的，可保 存于饱和氯化钠溶液或 30甘油缓冲盐水溶液中，保存时间不超过 72 h。 5.2 显微镜检查 5.2.1 采集的样品制成触片，革兰氏染色，镜检。 5.2.2 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌形态学特征：革兰氏阴性小球杆菌或纤细的小杆菌，直径 0.52 nm，长度 60450 nm。有荚膜和菌毛，不形成芽孢且无鞭毛，有的成双排列。新鲜病料中常呈两极着 色，人工培养 2496 h 可见到丝状菌。 5.3 分离培养 5.3.1 对没有受污染
8、的新鲜病料用经火焰灭菌并冷却的接种环蘸取病料内部组织后划线接种于在血琼 脂或改良 TSA 培养基上，于 36 1培养 24 h 2 h，如菌落生长缓慢，可延长至 48 h2 h 后观察。 或无菌接种于改良 TSB 肉汤于 37培养 24 h 后，无菌操作将肉汤培养液划线接种于血琼脂或改良的 TSA 培养基上，37培养 24 h。 5.3.2 如被检样品腐败或污染，可在上述培养基中加入洁霉素（1 ug/mL）、杆菌肽（100 ug/mL）、 制霉菌素（50 ug/mL），抑制其他杂菌生长。 5.3.3 在改良 TSA 培养基上菌落特征：圆形、边缘整齐、表面光滑湿润、灰白色、半透明、针尖大小、 凸
9、起、露珠样。 5.3.4 在血琼脂培养基上菌落特征：乳白色、露珠状、中间微隆起、呈 - 溶血。 5.3.5 在巧克力培养基上菌落特征：针尖大小、约 23 mm 大小，灰白色、圆形隆起、闪光不透明。 5.3.6 卫星现象：取纯化后的单菌落划线接种于改良 TSA 培养基，再垂直于接种线水平划线接种金黄 色葡萄球菌，37恒温培养箱中培养 24 h 后，可见在分离菌和金黄色葡萄球菌划线交叉处细菌菌落生 长较好，距离交叉处越远细菌生长越差，呈“卫星现象”生长。 5.4 生化反应试验 能分解木糖、甘露醇、葡萄糖、甘露糖、蔗糖、果糖和麦芽糖，不能分解乳糖、七叶苷、山梨醇、 棉子糖、阿拉伯糖和鼠李糖。 ONP
10、G 试验、尿素酶试验、硫化氢试验、硝酸盐还原试验阳性，靛基质试验、甲基红试验、V-P 试 验和氧化酶试验均为阴性。 5.5 动物回归试验 DB34/T 29972017 4 5.5.1 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌对小鼠、大鼠、豚鼠、家兔均有致病力，其中以小鼠最为敏感。试 验所需的实验动物的等级可按照 GB 14922.2 的规定选择。 5.5.2 将肺、肝、脾、淋巴结和扁桃体磨碎，用无菌 PBS 制成 1:51:10 组织悬液，或将 24 h 的肉 汤纯培养物做动物试验用。小鼠腹腔注射组织悬液 0.2 mL 或纯培养菌液 0.1 mL，接种后小鼠出现轻 微跛行，食欲减退甚至废绝，身体蜷缩，呼吸急
11、促并伴有抽搐，精神沉郁，小鼠死亡前出现严重昏迷及 呼吸困难。死亡小鼠的气管和支气管充满泡沫血色粘液分泌物；肺充血、出血，肺泡间质水肿，同时伴 有纤维素性胸膜肺炎等症状，肝部肿大 。 以死亡小鼠的心血或脏器制成涂片，革兰氏染色，镜检，可 见猪传染性胸膜肺炎放线杆菌；同时在血琼脂培养基或改良 TSA 培养基上作分离培养，可见猪传染性胸 膜肺炎放线杆菌的典型菌落。 5.6 PCR 鉴定 见附录B。 5.7 血清型鉴定 若需鉴定血清型时可按照 NY/T 537 的规定执行。 6 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌与副猪嗜血杆菌鉴别 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌与副猪嗜血杆菌均为革兰氏阴性小杆菌，形态很相似，因此在鉴
12、定中应 注意区别，两种细菌的区别应符合表1 的规定。 表1 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌与副猪嗜血杆菌鉴别要点 细菌种类 溶血性 CAMP 尿素酶 木糖 甘露醇 甘露糖 青霉素 最适动物模型 猪胸膜肺炎放线杆菌 + + + + + + 敏感 小鼠 副猪嗜血杆菌 - - - - - - 抵抗 豚鼠 注1： +：阳性； 注2： -：阴性； 注3： CAMP：葡萄球菌可增强其溶血环。 7 结果报告 7.1 综合以上培养形态与染色特性，生化反应试验，动物回归试验，PCR 鉴定，血清学分型鉴定及其 与副猪嗜血杆菌的鉴别结果，进行报告。 7.2 符合 5.2、5.3、5.4、5.5，可确定为猪传染性胸膜肺炎放
13、线杆菌。或符合 5.3、5.6，可确定为猪 传染性胸膜肺炎放线杆菌。 7.3 符合 7.1 且根据 5.7，可确定为某种血清型的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌。 DB34/T 29972017 5 A A 附 录 A （规范性附录） 培养基的配制 A.1 血琼脂培养基（BA） A.1.1 成分 TSA YE 琼脂 24.0 g 无菌绵羊血 25 mL 超纯水 500 mL A.1.2 制法 将 24.0 g TSA YE 琼脂溶于 500 mL 超纯水中，充分搅拌，待完全溶解混匀后，121高压灭菌 20 min。待培养基冷却至 55左右时, 以无菌方式添加无菌绵羊血，混匀，倾注无 菌平皿，4保存备
14、用。 A.2 改良 TSB 液体培养基 A.2.1 成分 TSB YE 琼脂 18.0 g 无菌小牛血清 50 L/mL 辅酶(NAD) 1030 L/mL 超纯水 500 mL A.2.2 制法 将 18.0 g TSB YE 琼脂溶于 500 mL 超纯水中，充分搅拌，待完全溶解混匀后，每管 3 mL 或 5 mL 分别分装于 12 100 和 15 150 规格的试管中，121高压灭菌 20 min。 待培养基冷却至 55左右时，每管均添加 NAD(1030 L/mL)以及无菌小牛血清(50 L/mL)，混 匀，倾注倒平皿，4保存备用。 A.3 改良 TSA 培养基 A.3.1 成分 T
15、SA YE 琼脂 24.0 g 无菌小牛血清 25 mL 辅酶(NAD) 515 mL 超纯水 500 mL DB34/T 29972017 6 A.3.2 制法 将 24.0 g TSA YE 琼脂溶于 500 mL 超纯水中，充分搅拌，待完全溶解混匀后，121高压灭菌 20 min。待培养基冷却至 55左右时，添加 25 mL NAD 以及 515 mL 无菌小牛血清，混匀，倾注倒 平皿，4保存备用。 A.4 巧克力琼脂培养基(CA) A.4.1 成分 TSA YE 琼脂 24.0 g 无菌绵羊血 25 mL 超纯水 500 mL A.4.2 制法 将 24.0 g TSA YE 琼脂溶于
16、 500 mL 超纯水中，充分搅拌，待完全溶解混匀后，121高压灭菌 20 min。待培养基冷却至 80左右时,以无菌方式添加无菌 绵羊血，混匀，倾注无菌平皿，4保存备 用。 A.5 改良 PPLO 琼脂培养基 A.5.1 成分 PPLO 琼脂 34.0 g 葡萄糖 1.0 g 酵母提取物 10 g 无菌小牛血清 50 mL 辅酶(NAD) 1030 mL 超纯水 1000 mL A.5.2 制法 将 34.0 g PPLO 琼脂、1.0 g 葡萄糖、10 g 酵母提取物溶于 1000 mL 超纯水中，充分搅拌，待 完全溶解混匀后，121高压灭菌 20 min。待培养基冷却至 55左右时 ,添
17、加 50 mL NAD 以及 1030 mL 无菌小牛血清，混匀，倾注无菌平皿，4保存备用。 A.6 无菌 PBS 溶液 A.6.1 成分 十二水合磷酸氢二钠 1.5 g 氯化钾 0.1 g 氯化钠 4.0 g 磷酸二氢钾 0.1 g 蒸馏水 500 mL DB34/T 29972017 7 A.6.2 制法 将 1.5 g 十二水合磷酸氢二钠、0.1 g 氯化钾、4.0 g 氯化钠、0.1 g 磷酸二氢钾溶于 500 mL 超纯水中，充分搅拌，待完全溶解混匀后，121高压灭菌 20 min，保存备用。 DB34/T 29972017 8 B B 附 录 B （规范性附录） 猪传染性胸膜肺炎放
18、线杆菌聚合酶链式反应（PCR）鉴定 B.1 仪器设备和材料 B.1.1 主要仪器 PCR 扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统、恒温振荡培养箱、超净工作台、水浴锅、高速冷冻离心机、 电热压力蒸汽灭菌器 、 移液器。 B.1.2 主要试剂 2Taq PCR Master Mix、分子量指示物（100 bp600 bp DNA Marker）、超纯水、琼脂糖、10 mg/mL 溴化乙锭（EB）、Tris-乙酸电泳缓冲液(TAE)、 TAE使用液、1.0琼脂糖凝胶。 B.1.3 引物序列 上游引物：5 -GATAAACCTTTTCCGGAATT-3 下游引物：5 -TACCACACCGTGTTTATCAA-
19、3 B.2 操作步骤 B.2.1 细菌基因组 DNA 的提取 采用煮沸法。即： 1) 取 1 mL 过夜培养菌液加入 1.5 mL 离心管中，以 12000 r/min 离心 5 min； 2) 弃上清液，加入 50 L 超纯水混匀； 3) 置沸水中煮沸 10 min，再冰浴 5 min； 4) 重复步骤 ； 5) 再以 12000 r/min 离心 5 min，取上清液即为 DNA 模板。 B.2.2 PCR扩增 检测过程应同时做阳性和阴性空白对照。阳性对照模板为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌，阴性空白对 照为灭菌超纯水。 PCR 反应体系：总体积为 25 L，其中含有 12.5 L 的 2 Ta
20、q PCR Master Mix，10 mol/L 上、 下游引物各 1 L，DNA 模板 5 L，灭菌超纯水 5.5 L。 PCR 扩增参数：95预变性 5 min；95变性 45 s，57退火 2 min，72延伸 1 min，共 3 个 循环；95变性 20 s，57退火 1 min，72延伸 1 min，共 30 个循环；最后 72再延伸 10 min 。 B.2.3 PCR扩增产物电泳检测 用 100 mL 1 TAE 缓冲液制备 1.0琼脂糖凝胶，加入 5 L 10 mg/mL EB。 在 1 TAE 缓冲液中，取 7 L PCR 扩增产物加入点样孔进行电泳，电压 100 V，电流 100 A，电 泳约 30 min。用凝胶成像仪观察分析，并记录、保存电泳结果。 DB34/T 29972017 9 B.2.4 结果判定 目的基因大小为 342 bp。 阳性对照扩增出 342 bp，阴性空白对照孔未见有 PCR 扩增条带，表明试验成立，否则应重做。 试验成立，被检样品孔如发现有 342 bp 大小的扩增条带，则判定阳性（），猪传染性胸膜肺炎 放线杆菌 PCR 检测结果电泳图见图B.1；被检样品孔如未发现有 342 bp 大小的扩增条带，则判为阴性 （）。 图B.1 猪传染性胸膜肺炎防线杆菌 PCR 检测结果电泳图 _
