1、ICS 65.020 B 04 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 27212016 转基因棉花土壤和水体环境安全检测 技术操作规程 Code of practice for technology of soil and water environmental safety detection of transgenic cotton 文稿版次选择 2016 - 09 - 27发布 2016 - 10 - 27实施 安徽省质量技术监督局 发 布 DB34/T 27212016 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省农业科学院棉花研
2、究所提出。 本标准归口单位：安徽省农业标准化技术委员会。 本标准起草单位：安徽省农业科学院棉花研究所、中国农业科学院棉花研究所、上海市农业科学院 生物技术研究所。 本标准主要起草人：郑曙峰、刘小玲、雒珺瑜、刘华、陈敏、李常凤、王维、徐道青、阚画春、崔 金杰、唐雪明。 DB34/T 27212016 1 转基因棉花土壤和水体环境安全检测技术操作规程 1 范围 本标准规定了转基因棉花土壤养分（有机质、全氮、硝态氮、铵态氮、有效磷、速效钾）、土壤线 虫、土壤酶活性（脲酶、碱性磷酸酶、过氧化氢酶）、土壤微生物多样性及土壤、水体中 Bt 蛋白含量 的术语与定义、取样方法、检测方法等技术要求。 本标准适用
3、于转基因棉花土壤和水体环境安全检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 LY/T 1228 森林土壤氮的测定 LY/T 1234 森林土壤钾的测定 NY/T 88 土壤全磷测定法 NY/T 1121.1 土壤检测 第1部分：土壤样品的采集、处理和贮存 NY/T 1121.6 土壤检测 第6部分：土壤有机质的测定 NY/T 1121.24 土壤检测 第24部分:土壤全氮的测定 自动定氮仪法 NY/T
4、1121.25 土壤检测 第25部分:土壤有效磷的测定 连续流动分析仪法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 贝尔曼浅盘法 Baermann tray method 将 10 目不锈钢筛盘放入配套的浅盘中，在筛盘上放置两层纱网，并加一层线虫滤纸，把土样均匀 铺在滤纸上，加水至浸没土壤，在 20室温条件下经过 48 h 后，收集浅盘中的水，通过 3 个筛网过 筛、冲洗，收集后计数的一种土壤线虫分离方法。 4 检测方法 4.1 原理 4.1.1 采用贝尔曼浅盘法分离土壤线虫，鉴定出线虫的营养性类群，通过引入多样性指数、均匀度指 数等生态学指数进行线虫群落多样性的检测分析。 DB3
5、4/T 27212016 2 4.1.2 采用苯酚-次氯酸钠比色法，根据酶促产物氨与苯酚次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚来分析土壤 脲酶活性。 4.1.3 采用磷酸苯二钠比色法，即以磷酸苯二钠为基质，酶解释放出的酚，使其与氯代二溴对苯醌亚 胺试剂反应生色测定出游离的酚量来表示土壤碱性磷酸酶的活性。 4.1.4 采用高锰酸钾滴定法，即用高锰酸钾溶液滴定过氧化氢分解反应，剩余过氧化氢的量来表示土 壤过氧化氢酶活性。 4.1.5 采用PCR-DGGE技术进行微生物多样性分析。 4.1.6 采用酶联免疫法检测转基因棉花土壤、水体中Bt蛋白的含量。 4.2 仪器 4.2.1 电子天平（感量0.01 g）、冰箱
6、、恒温水浴锅、体视显微镜（40）、倒置显微镜（100 和 400）。 4.2.2 研磨机、玻璃研钵、土壤筛：孔径2 mm（10目）；1 mm（16目）、分析天平、50 ml三角瓶、 200 ml三角瓶、恒温培养箱、50 mL容量瓶、紫外可见分光光度计、震荡机、 滴定管。 4.2.3 高速冷冻离心机（-1140，离心力大于30,000 g）、PCR扩增仪、电泳仪等。 4.2.4 研钵、冷冻离心机（-1140，离心力大于30,000 g）、酶标仪（波长340-850 nm）、摇 床、低温冰箱、单道微量移液器（2.5 L、10 L、20 L、100 L、200 L、1000 L，连续可调）、 多道微
7、量移液器（8道或12道，10 L、100 L、300 L，连续可调）。 4.3 试剂及配制方法 4.3.1 试剂要求 除非另有说明，仅使用分析纯试剂和符合 GB/T 6682 规定的一级超纯水。 4.3.2 4福尔马林 将 100 mL 40福尔马林溶液加入到 900 mL 的水中，混匀。 4.3.3 甘油-酒精-水混合液 将 100 mL 甘油和 400 mL 酒精加入到 500 mL 的水中，混匀。 4.3.4 10尿素 称取 10 g 尿素，用水溶至 100 mL。 4.3.5 柠檬酸盐缓冲液（PH6.7） 称取 184 g 柠檬酸和 147.5 g 氢氧化钾溶于蒸馏水。将两溶液合并，用
8、 1 mol/L NaOH 将 pH 调 至 6.7，用水稀释至 1000 mL。 4.3.6 苯酚钠溶液（1.35 mol/L） 称取 62.5 克苯酚溶于少量乙醇，加 2 mL 甲醇和 18.5 mL 丙酮，用乙醇稀释至 100 mL（A）， 存于冰箱中；27 克 NaOH 溶于 100 mL 水（B）。将 AB 溶液保存在冰箱中。使用前将 2 溶液各 20 mL 混合，用蒸馏水稀释至 100 mL。 4.3.7 次氯酸钠溶液 DB34/T 27212016 3 用水稀释试剂，至活性氯的浓度为 0.9，溶液稳定。 4.3.8 氮的标准溶液 精确称取 0.4717 克硫酸铵溶于水并稀释至 1
9、000 mL，得到 1 mL 含有 0.1 mg 氮的标准液。使用 前将此溶液稀释 10 倍使用。 4.3.9 缓冲液:硼酸盐缓冲液（pH 9.6） 称取 19.05 g 硼砂溶至 1 L，配成 0.05 mol/L 硼砂溶液；称取 8 g NaOH 溶至 1 L，配成 0.2 mol/L NaOH 溶液；取 50 mL 的 0.05 mol/L 硼砂溶液加 23 mL 的 0.2 mol/L NaOH 溶液稀释至 200 mL。 4.3.10 氯代二溴对苯醌亚胺试剂 称取 0.125 g 氯代二溴对苯醌亚胺，用 10 mL 96乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。保 存的黄色溶液未变褐色之
10、前均可使用。 4.3.11 酚标准溶液 称取 1 g 重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至 1 L，存于棕色瓶中。取 10 mL 酚原液稀释至 1 L，配制 0.01 mg/mL 酚工作液。 4.3.12 0.3过氧化氢溶液 取 1 mL 的 30 H2O2 加 99 mL 蒸馏水。 4.3.13 3 mo1/L硫酸 取 10 mL 硫酸加 50 mL 蒸馏水。 4.3.14 0.1 mo1/L高锰酸钾溶液 称取 1.58 g 的 KMnO4 加 100 mL 蒸馏水。 4.3.15 PCR扩增反应试剂 10Bueffr(Mg 2+ )5.0 L， dNTP(10 mmol/L)5.0 L，上下游引物(
11、10 mol/L)各 1.2 L，模板(土 壤 DNA) 3.0 L，TaqDNA 聚合酶(5 U/L)0.5 L，用无菌 ddH2O 50 L。 4.3.16 Cry1Ab/Cry1Ac平板试剂盒 96 孔板，Cry1Ab/Cry1Ac 标准品，Cry1Ab/Cry1Ac 偶联的酶标抗体，显色剂。 5 操作步骤 5.1 样品采集与处理 5.1.1 土壤样品采集所用方法为正方形五点随机取样法。用土钻采集表层10 cm，直径3 cm的土壤， 再将 5个采样点的土壤混合成一个混合土样，装入自封袋（或无菌袋），作好标签，带回实验室处理。 5.1.2 土壤酶活性测定是用过16目筛的风干土壤样品。 5.
12、1.3 土壤线虫多样性分析是将带回的土样经充分混匀后过4目筛以除去植物根系和残渣等，于4 冰箱保存，并在两周内完成线虫分离。 DB34/T 27212016 4 5.1.4 土壤微生物多样性分析是将无菌自封袋的土壤样品放入 -20保存待用。 5.1.5 水体样品采集是在转基因棉田周围自然水体中，用50 mL离心管取水，密封后放在装有冰袋的 泡沫塑料盒中保存，带回实验室后将水样品进行过滤，去除其中的杂质，4下3000 rpm离心10 min， 将上清液置于 -20保存备用。 5.2 土壤养分的检测 按 LY/T 1228、LY/T 1234、NY/T 88、NY/T 1121.1、NY/T 11
13、21.6、NY/T 1121.24 和 NY/T 1121.25 的规定执行。 5.3 土壤线虫的检测 5.3.1 线虫的分离 将 10 目不锈钢筛放入浅盘中，在筛盘上粘上一层线虫滤纸，称取 50 g 鲜土并均匀地铺在线虫滤 纸上，加水至刚好浸没土样。将浅盘置于 24室温条件下分离 48 h。用 2 个套在一起的 500 目钢筛 过筛，收集浅盘中的线虫悬液，并用自来水冲洗 3 遍。将 2 个钢筛里的线虫都洗到 60 mm 透明的小 塑料培养皿中。分离得到线虫溶液经 60水浴后，保存于 4的福尔马林溶液中。 5.3.2 线虫的计数 线虫计数通过体视显微镜直接观察得到，重复 3 次取平均值，以估算
14、样品中的线虫数量，并折算 成 100 g 干土中线虫的数量。 5.3.3 线虫的鉴定 在每个样品中随机挑取 100 条左右线虫放入甘油、洒精和水的混合溶液中，脱水两周后制片，在 倒置显微镜下鉴定至属，并划分为不同的营养类群：植物寄生线虫、食细菌线虫、食真菌线虫、杂食捕 食性线虫，以及不同的生活 cp 值。 5.3.4 线虫的结果计算与数据分析 5.3.4.1 香农-威纳多样性指数(H) 见公式（1） H=-Pi(lnPi) . (1) 式中： Pi 属 i 的个体总数占总个体数的比例。 5.3.4.2 Pielou均匀度指数(J) 见公式（2） J= H/lnS . (2) 式中： H 实际观
15、察的物种多样性指数， S 为群落中的总物种数。 5.3.4.3 辛普森优势度指数（) 见公式（3） DB34/T 27212016 5 =Pi 2 . (3) 式中： Pi 属 i 的个体总数占总个体数的比例。 5.3.4.4 营养多样性指数(TD) 见公式（4） TD=1/Pi 2 . (4) 式中： Pi 为各营养类群在线虫群落中所占的比例。 5.3.4.5 成熟指数(MI) 见公式（5） MI=v(i)f(i) . (5) 式中： v(i) 根据自由生活线虫在生态演替中不同生活策略分别赋予的 c-p 值； f(i) 某一科/属(i)在自由生活线虫（不包括植物寄生线虫）总数中所占比重。 5
16、.3.4.6 富集指数(EI)和结构指数(SI) 见公式（6）（10） EI=100e/(e+b) . (6) SI=100s/(s+b) . (7) b=Ba2+Fu2 . (8) e=Ba1W1+Fu2W2 . (9) s=(BanWn)+(CanWn)+(FunWn)+(OmnWn) . (10) 式中： n=35； W 各类群加权数，W1=3.2，W2=0.8，W3=1.8，W4=3.2，W5=5.0； 各类群字母代表各类群线虫丰度。 5.4 土壤酶活性的检测 5.4.1 土壤酶标准曲线绘制 5.4.1.1 土壤脲酶活性标线绘制 吸取配置好的氮溶液 10 mL，定容至 100 mL，即
17、稀释了 10 倍，吸取 0，1，3，5，7，9，11，13 mL 移至 50 mL 容量瓶，加水至 20 mL，再加入 4 mL 苯酚钠，仔细混合，加入 3 mL 次氯酸钠，充分 摇荡，放置 20 min，用水稀释至刻度。将着色液在紫外分光光度计上于 578 nm 处进行比色测定，以 标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。 5.4.1.2 土壤碱性磷酸酶活性标线绘制 DB34/T 27212016 6 取 0、1、3、5、7、9、11、13 mL 酚工作液，置于 50 mL 容量瓶中，每瓶加入 5 mL 硼酸缓冲液 和 4 滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30 min
18、 后，在紫外可见分光光度计上 660 nm 处 比色。以显色液中酚浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。 5.4.2 高锰酸钾的标定 准确称取约 0.2 g 在 110干燥至恒量的基准草酸钠。加入 250 mL 新煮沸过的冷水、10 mL 硫 酸，搅拌使之溶解。将草酸钠溶液加热到 7585 (即开始冒蒸气时的温度)，趁热用待标 KMnO4 溶 液进行滴定。开始滴定时反应速度很慢，待溶液中产生 Mn 2+ 后，反应速度加快，但滴定时仍必须是逐 滴加入，至溶液呈粉红色，半分钟内不褪色即为终点。注意滴定结束时的温度不应低于 60。 5.4.3 土壤酶活性测定 5.4.3.1 土壤脲酶活性测定
19、取 5 g 过 16 目筛的风干土样，置于 50 mL 三角瓶中，加 1 mL 甲苯。于 15 min 后，先加入 10 尿素 10 mL 后，再加入 pH 6.7 柠檬酸盐缓冲液 20 mL。摇充分后 37恒温培养 24 h。取出后用中 速定量滤纸过滤，将吸 3 mL 滤液置于 50 mL 容量瓶中，然后每瓶中加入 17 mL 蒸馏水。再吸苯酚钠 溶液 4 mL 和次氯酸钠溶液 3 mL 边加边摇匀。于室温静置 20 min 显色后，定容至 50 mL。溶液呈现 （青定）酚的蓝色。1 h 内在紫外可见分光光度计上于 578 nm 波长处进行比色。无土对照：不加土样， 其他操作与样品实验相同。
20、以检验试剂纯度，整个实验设置一个对照。无基质对照：以等体积的水代替 基质，其他操作与样品实验相同。每个土样都设此对照。 5.4.3.2 土壤碱性磷酸酶活性测定 取 5 g 过 16 目筛的风干土样，置于 200 mL 三角瓶里，加 2.5 mL 甲苯，轻摇 15 min 后，加 入 20 mL 0.5磷酸苯二钠,仔细摇匀后放入恒温箱，37下培养 24 h。取出后在培养液加入 100 mL 0.3硫酸铝溶液并过滤。吸取 3 mL 滤液于 50 mL 容量瓶中，然后加入 5 mL 硼酸缓冲液和4滴氯代 二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30 min 后，在紫外可见分光光度计上 660 nm 处
21、比色。无 土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。以检验试剂纯度，整个实验设置一个对照。无基质对照： 以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。每个土样都设此对照。 5.4.3.3 土壤过氧化氢酶活性测定 取 2 g 风干土置于 100 mL 的三角瓶中，加入蒸馏水 40 mL 和 0.3过氧化氢溶液 5 mL，120 rpm 转速振荡 20 min。震荡结束后取出来加入 3 mo1/L 的 H2S04 5 mL，过滤要慢速度，将滤液 25 mL 移 至广口三角饼中，用 0.1 mol/L 的高锰酸钾滴定至颜色为淡粉红色。无土对照：不加土样，其他操作 与样品实验相同。以检验试剂纯度，整个
22、实验设置一个对照。无基质对照：以等体积的水代替基质，其 他操作与样品实验相同。每个土样都设此对照。 5.4.4 土壤酶活性计算 5.4.4.1 土壤脲酶活性计算 土壤脲酶活性以 24 h 后 100 g 土壤中 NH3N 的毫克数表示。 见公式（11） M（X样品X无土X无基质）10010 . (11) 式中： M 土壤脲酶活性值； DB34/T 27212016 7 X 样品 样品实验的光密度值在标准曲线上对应的 NH3N 毫克数； X 无土 无土对照实验中的光密度值在标准曲线上对应的 NH3N 毫克数； X 无基质 无基质对照实验中的光密度值在标准曲线上对应的 NH3N 毫克数； 100
23、样品定容的体积与测定时吸取量的比值； 10 酶活性单位的土重与样品土重之比值。 5.4.4.2 土壤碱性磷酸酶活性计算 以 24 h 后 1 g 土壤中释放出的酚的质量（mg）表示磷酸酶活性。 见公式（12） M=（X样品X无土X无基质）Vnm . (12) 式中： M 土壤碱性磷酸酶活性值； X 样品 样品实验的光密度值在标准曲线上对应的酚毫克数； X 无土 无土对照实验中的光密度值在标准曲线上对应的酚毫克数； X 无基质 无基质对照实验中的光密度值在标准曲线上对应的的酚毫克数； V 显色液体积； n 分取倍数，浸出液体积吸取滤液体积； m 烘干土重。 5.4.4.3 土壤过氧化氢酶活性计算
24、 土壤过氧化氢酶活性以 1 g 土壤所消耗的高锰酸钾的毫克数来表示。 见公式（13） MXaXbXc . (13) 式中： M 土壤过氧化氢酶活性值； Xa 样品实验 25 mL 滤液所消耗的高锰酸钾量（毫升数）； Xb 无土对照实验中 25 mL 滤液所消耗的高锰酸钾量（毫升数）； Xc 无基质对照实验中 25 mL 滤液所消耗的高锰酸钾量（毫升数）。 5.5 土壤微生物多样性的检测 5.5.1 微生物总DNA的提取 称取 0.5 g 玻璃珠加入到 0.5 g 土壤样品中，然后加入 1 mL SLX-MLus 缓冲液，漩涡震荡 5 min， 再加入 100 L DS 缓冲液，混匀，70水浴
25、10 min，上下颠倒混匀。3000 rpm 室温离心 3 min，取 800 L 上清液至 2 mL 离心管中，再加入 270 L P2 缓冲液，混匀。冰浴 5 min，4，13000 g 离心 5 min，转移上清液至 2 mL 离心管中，加入 0.7 倍体积异丙醇，颤倒 30 次，混匀。4，13000 g 离 心 10 min，弃上清，倒置于滤纸上控干。加 200 L 洗脱缓冲液，涡旋 10 s 混匀；70水浴 20 min， 再加入 100 L HTR 试剂，混匀，室温放置 2 min；13000 g 离心 2 min，吸取上清液转至新的 2 mL 离 心管中，加入等体积 XP2 缓冲
26、液，混匀。将吸附柱套入收集管，样品倒入吸附柱中，10000 g 离心 1 min， 弃废液，重新套入收集管，加入 700 L SPW，10000 g 离心 1 min，弃废液，重新套入收集管，重复 上述操作 1 次。套入收集管，13000 g 条件下，空管离心 2 min，取吸附柱套入 1.5 mL 离心管中， 加入 50 L 洗脱缓冲液，70水浴 15 min，13000 g 离心 1 min，重复上述操作 1 次，终体积为 100 DB34/T 27212016 8 L。所有的 DNA 样品用 1琼脂糖凝胶电泳进行检测，于 -20保存。所得微生物基因组大小均为 1.5 Kb 左右，条带较为
27、清晰。经吸光度检测后需满足后续 PCR 的要求。 5.5.2 基因组DNA的PCR扩增 以 4.4.6 的 DNA 为模板，NS7-GC、NS8 为引物对基因组 DNA 进行了特异扩增，得到了大小为 340 bp 左右的清晰条带。94预变性3 min，94变性 45 s，50退火 45 s，72延伸 45 s，进行 35 个 循环，72延伸 10 min。PCR 完成后，取 5 L 用 1琼脂糖凝胶电泳进行检测。 5.5.3 DGGE电泳 使用 Bio-rad 的 DcodeTM 系统对 PCR 产物进行变性梯度凝胶电泳（DGGE），制备浓度为 8的 聚丙烯酰胺凝胶，变性梯度为 35-65（1
28、00的变性剂为 6.4 M 的尿素和 40的去离子甲酰胺）， 电泳缓冲液为 1TAE（40 mmol/L 乙酸，1 mmol/L EDTA, 40 mmol/L Tris, pH 7.2），上样量为 15 l PCR 产物+4 l 6酚蓝二甲苯氰溶液。电泳条件为：温度 60，电压 80 V，时间 12 h.电泳完毕后， 用 SYB Green I（1TAE，1:10000 稀释）染色 60 min，然后用 Bio-rad 凝胶成像系统进行拍照并对 结果进行分析。 5.5.4 微生物多样性指示指标计算 5.5.4.1 丰度 丰度是指某个样品中所有条带的总和，可以在一定程度上反映群里中优势菌群的多
29、样性。 5.5.4.2 优势度 优势度是指样品中某个条带峰面积占此样品总体峰面积的比例，它反映的是某个菌种菌体数量的多 少。通过比较优势度，可以直观的了解到样品中优势菌群的变化情况。 5.5.4.3 Shannon-Weiner指数 Shannon-Weiner 指数表示的是样品中菌群的种类以及菌体数量分配均匀度的情况，即菌群种类越 多或者菌体数量在各条带中分配越均匀，其值越大，微生物多样性越高。 5.5.4.4 相似度指数 相似度指数（戴斯系数 Cs）主要反映的是各样品的条带图谱的相似性关系，其数值的大小代表了 两个样品中菌群结构相似性程度。数值越大，表明相似度越高。 5.5.4.5 辛普森
30、多样性指数 辛普森多样性指数用于判断群落物种多样性，其值越高，说明物种多样性越高。 5.6 Bt蛋白测定 5.6.1 超滤浓缩 吸取 15 mL 处理后的水体上清液于 Amicon Ultra-15 超滤离心管中，4000 rpm 离心 30 min。离 心结束后，每个超滤管内加入 2.0 mL PBS 提取液轻轻冲洗滤膜，继续离心 20 min，上清液即为浓缩 了的含有 Bt 蛋白的溶液。 5.6.2 检测步骤 DB34/T 27212016 9 取离心后的上清液 50 L 加入到已包埋好抗体的 96 孔板中，180 r/min 振荡培养 1.5 h，分别 加入空白对照和阳性对照各 50 L
31、；震荡 2030 s，混匀，于 200 r/min 振荡室温保湿孵育 12 h； 将孔中液体倒入废液池中，注满洗涤缓冲液，重复洗涤三次，最后尽量将洗涤液倒干净；加入 100 L 基 质液，震荡 2030 s，混匀，于 200 r/min 振荡室温保湿孵育 1530 min；加入 100 L 终止液， 充分混匀，30 min 内在波长 450 nm 处读取吸光值。 5.6.3 Bt蛋白含量计算 将阳性质控物按照一定梯度进行稀释，以阳性质控物中 Bt 蛋白浓度为横坐标，扣除空白对照 OD450 吸光值为纵坐标，进行回归分析，建立标准曲线，获得标准曲线方程。 测定样品 OD450 吸光值，扣除空白对照后带入上述所得方程，即得到样品中 Bt 蛋白含量。 _
