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    DB34 T 2813-2017 梨炭疽病菌检疫鉴定方法.pdf

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    DB34 T 2813-2017 梨炭疽病菌检疫鉴定方法.pdf

    1、ICS 65.020.20 B 16 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 28132017 梨炭疽病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Colletotrichum gloeosporioides Penz 文稿版次选择 2017 - 03 - 30 发布 2017 - 04 - 30 实施 安徽省质量技术监督局 发布 DB34/T 28132017 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省检验检疫科学技术研究院提出。 本标准由安徽省动植物检验检疫标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位:安徽省检验

    2、检疫科学技术研究院、安徽省农科院植物保护与农产品质量安全 研究所。 本标准主要起草人:李云飞、陈雪娇、宗凯、杨雪、孙娟娟、郑海松、姚剑、陈雨、余晓峰、王满 满。 DB34/T 28132017 1 梨炭疽病菌检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了梨炭疽病菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于果实、苗木及其制品中梨炭疽病菌的检疫和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 梨炭疽病菌基本信息 学名: Col

    3、letotrichum gloeosporioides Penz. 分类地位:真菌界(Fungi),黑盘孢目(Melanconiales), 黑盘孢科(Melanconiaceae),炭疽 菌属( Colletotrichum),其有性阶段为围小丛壳( Glomerella cingulata)。 传播途径:梨炭疽病主要借助雨水、昆虫等进行近距离传播,借助果实、苗木及其制品等的调运进 行远距离传播。 4 方法原理 根据梨炭疽病菌在寄主上的为害症状(参见附录A),培养基上生长的菌落、菌丝、分生孢子和分 生孢子器等形态特征,以及 PCR 特异扩增片段大小进行结果判定。 5 仪器设备和主要试剂 5.

    4、1 仪器设备 生物显微镜、体视显微镜、高速冷冻离心机、纯水仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、PCR 仪、凝 胶成像系统、电泳仪、培养箱、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器。 5.2 主要试剂 5.2.1 除另有规定外,所有试剂均为分析纯或生化试剂,实验用水符合 GB/T 6682 的规定。 5.2.2 1次氯酸钠。 5.2.3 DNA 提取试剂:DNA 提取试剂盒, CTAB 裂解液(20 g/L CTAB,0.1 mol/L Tris,1.4 mol/L Nacl, 20 mmol/L EDTA-Na2),蛋白酶 K(20 mg/mL),苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),3 mol/L Na

    5、Ac(pH 5.2),异丙醇,70乙醇,无菌水。 5.2.4 PCR 试剂:10PCR buffer(含 25 mmol/L MgCl2),Taq 酶,dNTP。 DB34/T 28132017 2 5.2.5 凝胶电泳试剂:琼脂糖,TAE,Loading Buffer,EB。 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):马铃薯浸粉 5.0 g,葡萄糖 20.0 g,氯霉素 0.1 g,琼脂 13.0 g,蒸馏水定容至 1000 mL,调整 pH 值至 6.7 ,121高压灭菌 15 min。 6 病菌的鉴定 6.1 分离培养 挑取具有疑似症状的果实或植物组织,用解剖刀取植株病健交界处的组织,剪成约 0

    6、.4 cm0.4 cm 小段,用 1的次氯酸钠溶液消毒 60 s,无菌水洗涤 3 次,灭菌滤纸吸干水分后置于 PDA 培养基上, 在 2530,12 h 黑暗/12 h 光照(12 h 光暗交替)条件下培养,第 3 d 开始观察,根据组织周 围新生菌落的形态进行选取,取边缘菌丝转接纯化。 6.2 鉴定特征 PDA 培养基上,菌落圆形,绒毛状,气生菌丝生长较密集;菌落初期白色,后期四周呈灰白色,中 心逐渐转为灰黑色至墨绿色,背面可见粉红色分生孢子团,偶尔可见黑色圆点散布其中。分生孢子盘圆 形或近圆形,黑褐色,突起于培养基表面;分生孢子梗无色、圆柱形或棒状,其上着生单个孢子;分生 孢子圆柱形、单孢

    7、、无色,大小为 10 m35 m3.7 m7.0 m,中间有一油滴,参见附录B。子囊 壳暗褐色,烧瓶状,直径为 85 m300 m;子囊长棍棒形,平行排列于子囊壳内,大小为 55 m 70 m9 m,内含 8 个子囊孢子;子囊孢子单胞无色,卵圆形或长椭圆形,稍弯曲,12 m22 m3.7 m5.0 m。 6.3 PCR 检测 采用商业化试剂盒或 CTAB 法(参见附录C)提取疑似分离物 DNA,通过 PCR 反应检测。用梨炭疽 病菌 DNA 作阳性对照,其他真菌 DNA 作阴性对照,无菌水作空白对照。 7 结果判定 若形态特征符合 6.2 中描述,且分离物PCR检测为阳性,即可判定检出梨炭疽病

    8、菌;否则,判定为 未检出梨炭疽病菌。 8 样品保存 8.1 样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出梨炭疽病菌的样品应保存于 4冰箱中,以备复核。 该类样品保存期满后须经高压灭菌后方可处理。 8.2 菌株保存与处理 从检测样品中分离并鉴定为梨炭疽病菌的菌株,应妥善保存。将菌株接种 PDA 培养基斜面上, 2530 培养 5 d,然后 4冰箱保存,或将菌丝块转入 20灭菌甘油并混匀,-80长期保存。 对不需要长期保存的菌株应及时高压灭菌处理。 DB34/T 28132017 3 A A 附 录 A (资料性附录) 梨炭疽病菌为害果实及植株的症状 A.1 梨炭疽病菌为害果实的症状

    9、果实染病后,初果面现浅褐色水浸状小圆斑,后病斑渐扩大,色泽变深,并软腐下凹,病斑表面颜 色深浅交替,具明显同心轮纹。在病部表皮下形成很多小粒点,稍隆起,初褐色,后变黑色,即病原菌 分生孢子盘,分生孢子盘多排列成轮纹状,在温暖湿度大条件下,孢子盘突破表皮涌出粉红色粘质物, 即病菌分生孢子团块。病斑扩展致烂入果肉或直达果心,果实变褐有苦味,果实受害常呈圆锥形向果心 深入,致整个果实腐烂或干缩为僵果。 A.2 梨炭疽病菌为害植株的症状 枝梢染病多发生在枯枝或生长衰弱的枝条上, 初仅形成深褐色小型圆斑, 后扩展为长条形或椭圆形, 病斑中部凹陷或干缩,致皮层、木质部呈深褐色或枯死。叶片上发病,多在叶正面

    10、产生病症,叶片上数 个病斑可连片成不规则的黑褐色大斑使叶片焦枯, 有时可见明显的轮纹, 病斑可发生在叶脉间、 叶脉上、 叶缘、叶尖、叶柄上,叶背面病斑对应处为较光滑的褐色斑,发病的叶片过早脱落。 DB34/T 28132017 4 B B 附 录 B (资料性附录) 梨炭疽病菌为害果实的症状、病菌形态特征图 B.1 为害症状 见图B.1。 图B.1 果实被害状 B.2 病菌形态特征 见图B.2。 图中: 1.分生孢子盘剖面 2.分生孢子梗 3.分生孢子 4.子囊壳剖面 5.子囊 6.子囊孢子 图B.2 梨炭疽病菌 DB34/T 28132017 5 C C 附 录 C (资料性附录) 梨炭疽病

    11、病菌的 PCR 检测 C.1 DNA 提取 C.1.1 CTAB 法提取菌丝 DNA 的方法 C.1.1.1 样品用液氮碾碎,取 100 mg 至 2 mL EP 管,加入 1000 L CTAB 裂解液与 10 L 蛋白酶 K; C.1.1.2 65水浴 30 min,每隔 10 min 振荡混匀 1 次 ,12000 rpm 离心 10 min,将上清液移入 2 mL 新 EP 管中; C.1.1.3 加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)溶液,颠倒混匀,12000 rpm 离心 10 min; C.1.1.4 将上清液移入 2 mL 新 EP 管中, 加入等体积的异丙醇和 1/

    12、10 体积的 3 mo l/L NaAc(pH 5. 2),-20 放置 20 min,12000 rpm 离心 10 min; C.1.1.5 弃上清液,倒置晾干,加入 1 ml 70乙醇洗涤,12000 rpm 离心 10 min; C.1.1.6 弃上清液,室温倒置于吸水纸上晾干,将 DNA 沉淀溶于 50 L 无菌水中,-20保存备用。 C.1.2 试剂盒提取 DNA 的方法 按试剂盒说明书提取 DNA。 C.2 PCR反应 C.2.1 PCR扩增 梨炭疽病菌 C. gloeosporioides 特异性引物对 CgF:5- GGCCT CCCGCCTCCGGGCGGG -3 / Cg

    13、R:5- ACCTTTGAGGGCCTACATCAG -3,预期扩增产物为 329bp。PCR 反应程序为 94 5 min; 94 1 min, 63 30 s,72 1 min,35 个循环;72 7 min。 PCR 扩增反应体系见表C.1。 表C.1 PCR 扩增梨炭疽病菌反应体系 试剂名称 浓度 加样量 /L PCR buffer(含 25 mmol/L MgCl 2) 10 2.5 dNTP 各 2.5 mmol/L 0.5 正义引物 20 mol/L 1.0 反义引物 20 mol/L 1.0 TaqDNA 聚合酶 5 U/L 0.5 DNA 模板 50 ng/L 1.0 ddH2O 补至 25 L DB34/T 28132017 6 C.2.2 PCR扩增产物检测 扩增产物用 1.5琼脂糖凝胶在 1 TAE 缓冲液中电泳,EB 染色后用凝胶成像系统分析。 C.3 结果判定 PCR 扩增产物检测, 阳性对照出现一条 329bp 的 DNA 片段, 阴性对照和空白对照没有该核酸条带, 待检样品如出现 329bp 的 DNA 片段为检测结果阳性,如未出现 329bp 的 DNA 片段为检测结果阴性。 _


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