1、ICS 65.020.20 B 44 DB33 浙江省 地 方 标 准 DB33/T 2246 2020 猪流行性乙型脑炎病毒荧光定量 RT PCR检测方法 Real-time PCR detection technique for Japanese encephalitis virus 2020 - 03 - 03发布 2020 - 04 - 03实施 浙江省市场监督管理局 发布 DB33/T 2246 2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009的规定编写。 本标准由浙江省农业农村厅提出。 本标准由浙江省畜牧兽医和饲料标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：浙江省动物疫病预
2、防控制中心。 本标准主要起草人： 谢荣辉、张传亮、 吴赟竑、徐辉、刘霞、周蕾、柴娟、 虞 一聪 、王雅婷 、 周彩 琴、赵灵燕 、刘爱军、吴雪军。 DB33/T 2246 2020 1 猪流行性乙型脑炎病毒荧光定量 RT PCR检测方法 1 范围 本标准规定了猪流行性乙型脑炎病毒 （ Japanese encephalitis virus， JEV） 荧光定量 RT PCR检 测 的实验条件、操作步骤和结果判定等要求 。 本标 准适用于 猪流行性 乙型脑炎病毒核酸的检测 。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本 文件 。 2.1 猪 流行性乙型脑炎 由 猪 流行性乙型脑炎病毒引起的一种急性传
3、染病。猪的主要临床症状表现为高热、流产、死胎和公 猪睾丸炎。 3 实验条件 3.1 仪器 3.1.1 高速冷冻离心机 。 3.1.2 荧光定量 PCR 仪 。 3.1.3 生物安全柜 。 3.1.4 组织研磨仪 。 3.1.5 微量移液器 。 3.1.6 冰箱 。 3.1.7 涡旋混匀器 。 3.1.8 高压灭菌器 。 3.2 试剂 除特别说明外，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无 RNA酶污染的容器分装。 3.2.1 Trizol： 核糖核酸 （ Ribonucleic acid, RNA） 提取试剂 。 3.2.2 氯仿： 4 预冷。 3.2.3 异丙醇 ： 4 预冷。 3.2.4
4、焦炭酸二乙酯（ Diethylpyrocarbonate ,DEPC）水 ：取 DEPC 100 L，加超纯水至 100 mL，室 温过夜， 121 高压 灭菌 15 min，分装，冻存备用。 3.2.5 75%乙醇 ： 用 75 mL 无水乙醇，加 DEPC 水至 100 mL，混匀， 20 预冷 。 DB33/T 2246 2020 2 3.2.6 商品化的一步法实时荧光 RT-PCR 反应试剂 ： One Step Prime Script RT-PCR Kit（ Perfect Real Time， TAKARA)， 含有 2One Step RT-PCR Buffer 、 Ex Ta
5、q HS（ 5 U/ L） 、 PrimeScript RT Enzyme Mix 和 无 RNA 酶的水。 3.2.7 0.01mol/L PH7.4 磷酸盐缓冲液（ Phosphate buffered saline,PBS）：取 Na2HPO4.12H2O 2.9g, KCl 0.2g, KH2PO4 0.2g, NaCl 8g, 溶于 800 mL 去离子 水中， 充分搅拌溶解，滴加浓盐酸将 pH 调节至 7.4，然后加去离子水 定容至 1 L，高温灭菌 30 min， 室温保存 。 3.2.8 引物和探针，其序列如下： 上游引物 ： 5 GGCTCTTATCACGTTCTTCAAGT
6、TT-3， 下游引物 ： 5 TGCTTTCCATCGGCCYAAAA-3， 探针： 5 FAM-AGCATTAGCCCCGACCAAGGCG-TAMRA-3。 3.2.9 阳性对照：猪乙型脑炎活疫苗（ SA14-14-2 株）。 4 操作 步骤 4.1 样品采集 4.1.1 脑组织： 选择代表性病症的病死猪， 应无菌 采集脑组织 ，将采集到的脑组织装入到无菌离心管 中并编号，冷藏送检 或 -20 以下保存备用。 4.1.2 全血：用无菌注射器耳静脉采集猪血，将采集到的猪血装入到无菌离心管中并编号，冷藏送检 。 若不能及时送检的全血，应分离血清置于 -20 以下保存备用 。 4.2 样品 处理
7、 4.2.1 取待检脑组织 适量 装入 到无 菌离心管中，按 1： 10 体积加入 PBS，置于组织研磨仪 中充分 研磨。 将研磨 后 的 样品 ， 反复冻融 3 次， 10000 r/min 离心 5 min，取上清液至 无菌 离心管中 ，编号待检。 4.2.2 取全血 3500 r/min 离心 5 min，取 血清 至 无菌 离心管中 ，编号待检。 4.3 RNA提取 4.3.1 按下列步骤完成 RNA 提取，也可采用商品化的病毒 RNA 提取试剂盒。 4.3.2 取 n 个灭菌的 1.5mL 离心管，其中 n 为被检样品、阳性对照与阴性对照的和，对每个离心管进 行编号。 4.3.3 每
8、管加入 750 L Trizol，分别加入被检样品、阳性对照和阴性对照各 250ul,震荡数次，静置 5 min。 再 加入 200 L 预冷的 氯仿 ， 震荡混匀 ，静置 5 min， 于 4 C 12 000 r/min 离心 15 min。 4.3.4 取与 本标准 5.3.2 中相同数量的灭菌 1.5ml 离心管，并对每个离心管进行编号。 取 本标准 5.3.3 中离心后的上清液 （ 注意不吸出中间层 ）转移至相应的管中， 加入 等体积 异丙醇，混匀 ， 20 C 静置 30 min。 4.3.5 于 4 C 12 000 r/min 离心 15 min，弃上清，缓缓 加入 1 mL
9、75%乙醇 ，颠倒洗涤沉淀及管壁。 于 4 C 12 000 r/min 离心 10 min，弃上清，室温条件下干燥后 ，加入 30 L DEPC 处理水 ，轻轻混 匀，溶解管壁上的 RNA，以 4 000 r/min 离心 10 s,冰上保存备用。 提取的 RNA 应在 2 h 内进行 荧光 RT-PCR 扩增 ，若需长期保存，需置于 -70 C 冰箱 保存 。 4.4 荧光定量 RT PCR反应 4.4.1 反应体系组成 设立阳性对照、阴性对照，反应体系（ 20L）由表 1中物质组成 。 DB33/T 2246 2020 3 表 1 反应体系配制表 试剂 用量 L 2One Step RT
10、 -PCR Buffer 10 Ex Taq HS（ 5 U/L） 0.4 PrimeScript RT Enzyme Mix 0.4 上游引物 （ 10 mol/L） 0.4 下游引物 （ 10 mol/L） 0.4 探 针 (10 mol/L) 0.4 样品 RNA 4 RNase Free dH2O 4 总 量 20 4.4.2 反应条件 反转录： 42 15 min；预变性： 94 2 min；扩增 ： 94 10 s， 60 40 s， 45个循环， 60 时设置采集荧光。 4.4.3 荧光素的设定 Report Dye 设定为 FAM， Quencher Dye设定为 none。
11、5 结果判定 5.1 结果分析条件设定 直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性 样品 扩 增曲线的最高点为准。 5.2 质控标准 阳性对照的 Ct值应 30并出现典型的扩增曲线，阴性对照无 Ct值且无典型扩增曲线，二者同时成立 可判定试验成立，否则试验无效。 5.3 结果描述及判定 5.3.1 阴性 判定 无 Ct值，且无典型扩增曲线， 判 为阴性。 5.3.2 阳性 判定 Ct值 35，且出现典型扩增曲线， 判 为阳性。 5.3.3 可疑 判定 Ct值 35，且出现典型扩增曲线的样品 ，需 重复 检测； 重复 检测 结果 Ct值 38且 出现 典型扩增曲线 的 判 为 样品 阳性，否则判为阴性。
