1、ICS 11.220 B 41 DB33 浙江省 地方标准 DB33/T 2268 2020 猫细小病毒 PCR检测方法 PCR detection technique for feline panleukopenia virus 2020 - 06 - 30发布 2020 - 07 - 30实施 浙江省市场监督管理局 发布 DB33/T 2268 2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009的规定编写。 本标准由 浙江省农业农村厅 提出。 本标准由浙江省畜牧兽医和饲料标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：浙江省动物疫病预防控制中心 。 本标准 主要 起草人： 张红丽、徐 辉
2、、赵灵燕、周彩琴、 吴贇竑 、黄 靖、 吕见涛、 刘爱军、刘 霞、 吴雪军、孙冰冰 、章杭建。 DB33/T 2268 2020 1 猫细小病毒 PCR检测方法 1 范围 本标准规定了 猫细小病毒 PCR（ polymerase chain reaction） 的实验条件、操作步骤、结果判定 。 本标准适用于 猫细小病毒（猫泛白细胞减少症病毒） 的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅 注日期的版本 适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语
3、和定义 下列术语和定义适用于本 文件 。 3.1 猫细小病毒 Feline panleukopenia virus， FPLV 属细小病毒科，细小病毒亚科，牛犬细小病毒属成员，又称猫泛白细胞减少症病毒、猫传染性胃肠 炎病毒或猫瘟病毒。 4 实验条件 4.1 试剂 4.1.1 要求 除另有规定外，所用试剂 为分析纯 或生化试剂 ，水为符合 GB/T 6682要求 的灭菌双蒸水或超纯水。 4.1.2 试剂 4.1.2.1 核糖核酸酶（ 20 mg/mL） 。 4.1.2.2 10%十二烷基磺酸钠溶液 。 4.1.2.3 10 mg/mL 蛋白酶 K。 4.1.2.4 Tris-盐酸 饱和酚（ pH
4、 7.6）。 4.1.2.5 酚 -氯仿 -异戊醇混合液 （ 25： 24： 1） ： 在一灭菌棕色瓶中按 25： 24： 1比例分别加入 酚、 氯 仿、异戊醇 。 4.1.2.6 3 mol/L 乙酸钠（ pH 5.4） 。 4.1.2.7 琼脂糖。 DB33/T 2268 2020 2 4.1.2.8 10 g/L 溴化乙锭 （ ethidium bromide， EB）： 溴化乙锭 20 mg、加灭菌双蒸水至 20 mL 充 分溶解混匀而成。 4.1.2.9 50TAE 缓冲液 ： 羟基甲基氨基甲烷 （ Tris） 242 g、冰乙酸 57.1 mL、 0.5 mol/L 乙二铵四乙 酸
5、 二钠溶液 （ pH 8.0） 100 mL，加灭菌双蒸水至 1 000 mL 充分混匀。 4.1.2.10 加样缓冲液： 聚蔗糖 25 g、溴酚蓝 0.1 g、二甲苯青 0.1 g，加灭菌双蒸水至 100 mL充分溶 解混匀而成。 4.1.2.11 2.5 mmol dNTPs（ deoxyribonucleoside triphosphates， 脱氧核糖核苷三磷酸 ）。 4.1.2.12 10PCR Buffer。 4.1.2.13 DNA 分子量标准： DL2000。 4.1.2.14 引物 序列 FPLV-F： 5 CCAGCTGAGGTTGGTTATAGTG 3； FPLV-R：
6、5 GGTGCATTTACATGAAGTCTT GG 3。 4.2 仪器设备 4.2.1 高速冷冻离心机：要求最大离心力在 12 000rpm 以上。 4.2.2 PCR 扩增仪。 4.2.3 核酸电泳仪和水平电泳槽。 4.2.4 微波炉。 4.2.5 分析天平。 4.2.6 恒温水浴锅。 4.2.7 冷藏 冰箱和 低温冷冻 冰箱。 4.2.8 微量移液器。 4.2.9 凝胶成像系统（或紫外透射仪）。 4.2.10 高压灭菌锅。 4.2.11 超净工作台或生物安全柜 。 5 操作步骤 5.1 样品的采集和处理 5.1.1 采集动物 粪便 、肛拭子、全血或肠道等组织样品并进行处理 : a) 肛拭
7、子、粪便（加适量 PBS）等样品经 4 5 000 rpm/min离心 2 min，取上清液； b) 全血样品待血凝后经 5 000 rpm/min 离心 2 min，取血清； c) 取 0.1 g 肠道等样品 与灭菌 PBS（全称、浓度） 按 1： 5 的重量体积比制成悬液， 匀浆后，反复 冻融 3次， 在涡旋混合器上混匀后 经 4 5 000 rpm/min离心 10 min， 取上清液。 5.1.2 制备的样品在 2 8 保存 时间 不应超过 24 h，长期保存应分装成小管，置于 -20 以下 ，避 免反复冻融。 5.2 DNA的提取 5.2.1 设立阳性、阴性样品对照，阳性对照为 猫细
8、小病毒 阳性样品，阴性对照为 灭菌双蒸 水。 5.2.2 按下列步骤完成 DNA的提取 ，也可 选择市售商品化 DNA 提取试剂盒，完成 DNA 的提取 ： a) 取 1.5 mL灭菌离心管，加入处理样品 5.1.1 上清液 400 L和 30 L（ 20 mg/mL）核糖核酸酶， 混匀后，室温下作用 20 min； DB33/T 2268 2020 3 b) 加入 43 L 10%的十二烷基磺酸钠溶液和 5 L 蛋白酶 K， 42 水浴温育过夜（或 55 30 min 以上） ； c) 加入等量的 Tris-盐酸饱和酚，充分混匀， 12 000 rpm/min 离心 5 min，小心吸出上层
9、水相于 新的 1.5 mL 灭菌离心管中 ； d) 加等量的酚 -氯仿 -异戊醇（ 25： 24： 1），充分混匀， 12 000 rpm/min 离心 5 min，小心吸出上 层水相至新的 1.5 mL 灭菌离心管中 ； e) 加 1/10 体积 3 mol/L 的乙酸钠（ pH 5.4）， 2.5 倍体积预冷的无水乙醇 15 000 rpm/min 离心 20 min，弃去乙醇， 75%的乙醇洗涤沉淀一次后真空干燥 。 用 20 L 灭菌双蒸水溶解沉淀， -20 保存备用。 5.3 PCR反应 5.3.1 反应体系组成 设立阳性对照和阴性对照。按表 1 所述 反应体系组成 ，严格在冰盒上配
10、置 25 L PCR扩增体系。 表 1 每个样品反应体系配制表 试剂 用量（ L） 10 PCR buffer 2.5 dNTPs（ 2.5 mM） 2 FPLV-F/FPLV-R（ 20 uM） 各 0.5 TaqDNA 聚合酶 （ Taq DNA Polymerase） 0.2 DNA 模板 1 灭菌 双 蒸 /超纯水 18.3 总量 25 5.3.2 反应条件 94 3 min； 94 45 s， 55 30 s， 72 30 s，循环 35 次， 72 延伸 10 min 结束。 5.4 电泳 5.4.1 1%琼脂糖凝胶的制备 用琼脂糖 1.0 g， 0.5TAE 电泳缓冲液 100
11、mL，混匀后在微波炉中完全融化，待冷至 50 60 时， 加溴化乙锭（ EB）溶液 5 L，摇匀倒入电泳 板上，凝固后取下梳子，备用。 5.4.2 加样 取 5 L PCR产物与 0.5 L 10 加样缓冲液混合，加入琼脂糖凝胶板的加样孔中。 每次电泳加阳性 对照和阴性对照的扩增产物，并设立 DNA分子量标准 （ DL2000）做分子质量大小对照 。 5.4.3 电泳 DB33/T 2268 2020 4 盖好电泳仪，插好电极， 5 V/cm电压电泳， 30 min 45 min（指示试剂跑至 1/3 处） 。 5.4.4 结果观察 用紫外凝胶成像仪或者紫外透射仪观察扩增结果。 6 结果判定 在阳性对照出现 464 bp的 扩增带、阴性对照无 目的 条带 的 条件下， 待检样品出现 464 bp 的扩增条 带，则 判定为 样品阳性， 否则判定为阴性。 _
