1、ICS 65.020.30 B 43 DB33 浙江省 地 方 标 准 DB33/T 2247 2020 鸭坦布苏病毒 RT-PCR和实时荧光定量 RT-PCR检测方法 Method of RT-PCR and the real-time RT-PCR for the detection of duck tembusu virus disease 2020 - 03 - 03发布 2020 - 04 - 03实施 浙江省市场监督管理局 发布 DB33/T 2247 2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则编写。 本标准由浙江省农业农村厅提出。 本标准由浙江省畜牧兽
2、医和饲料标准化技术委员会归口。 本标准起草单位： 浙江省 动物疫病预防控制中心 、浙江省农业科学院畜牧兽医研究所。 本标准主要起草人：云涛、徐辉、周彩琴、张存、赵灵燕、余斌、吴赟竑、张传亮、吴雪军、黄晓 兵、冯肖肖、华炯钢、吕见涛、张娟敏、鲍伟华。 DB33/T 2247 2020 1 鸭坦布苏病毒 RT-PCR和实时荧光定量 RT-PCR检测方法 1 范围 本 标准 规定了鸭坦布苏病毒的反 转录 -聚合酶链式反应（ RT-PCR） 和 实时荧光定量 RT-PCR的实验条 件、操作步骤 和 结果判定等要求。 本 标准 适用于鸭坦布苏病毒核酸的检测。 2 术语和定义 2.1 鸭坦布苏病毒 （ D
3、uck Tembusu Virus， DTMUV） 属于黄病毒科、黄病毒属、蚊媒病毒类、 Ntaya病毒群，可引起鸭、鹅产蛋下降，雏鸭、雏鹅发病 死亡。 3 实验条件 3.1 主要仪器设备 3.1.1 PCR 仪 。 3.1.2 荧光定量 PCR 仪 。 3.1.3 微量移液器 。 3.1.4 组织匀浆器 。 3.1.5 电泳仪 。 3.1.6 电泳槽 。 3.1.7 水浴锅。 3.1.8 紫外凝胶成像系统 。 3.1.9 高速台式低温离心机。 3.1.10 生物安全柜。 3.2 试剂 3.2.1 0.01M 磷酸盐 缓冲液（ 0.01 mol/L， pH7.4 PBS）：称取 8.0 g N
4、aCl、 0.2 g KCl、 2.9 g Na2HPO412H2O、 0.2 g KH2PO4，将上述试剂溶于 800 mL 去离子水中，充分搅拌溶解，滴加浓盐酸将 pH 调节至 7.4，然 后加去离子水定容至 1 L，高温灭菌 30 min，室温保存。 3.2.2 氯仿。 3.2.3 异丙醇。 3.2.4 焦炭酸二乙酯（ DEPC）处理的灭菌去离子水：用 DEPC 50 L，加超纯水至 100 mL，室温过夜， 121 高压灭菌 15 min，分装到 1.5 mL DEPC 处理过的离心管，冻存备用 。 3.2.5 75%乙醇： 取 新开启的无水乙醇 75 mL，加 DEPC 水 至 10
5、0 mL，混匀， -20 预冷。 DB33/T 2247 2020 2 3.2.6 溴化乙锭 （ EB）：取 1.0 g 溴化乙锭，加去离子水，定容至 100 mL。充分溶解后的溴乙锭溶 液转移至棕色瓶中，室温避光保存，其工作浓度为 0.5 g /mL。 3.2.7 1TAE 缓冲液：取 242 g 羟基甲基氨基甲烷（ Tris）、 37.2 g 二水乙二铵四乙酸二钠、 57.1 mL 冰乙酸，加去离子水定容至 1 L，配置成 50TAE 电泳缓冲液 ； 量取 20 mL 的 50TAE 电泳缓冲液，加 入去离子水定容至 1 L，室温保存。 3.2.8 1%琼脂糖凝胶：称取 1.0 g 琼脂糖
6、，加入 1TAE 电泳缓冲液 100 mL，轻轻混匀后加热，使琼脂 糖完全熔 化 。 待 琼脂糖胶 冷至 50 60 时，加 EB 溶液（终浓度 0.5 g/mL）或 5 L 核酸染料，摇 匀后倒入制胶板中，厚度为 3 mm 5 mm，室温凝固后取下 电泳 梳子，备用。 3.2.9 DNA 相对分子质量标准物 Marker： DL 2000。 3.2.10 10加样缓冲液：称取 25 g 聚蔗糖、 0.1 g 溴酚蓝、 0.1 g 二甲苯青，加入灭菌双蒸水定容至 100 mL。 3.2.11 商品化的一步法实时荧光 RT-PCR 反应试剂盒。 One Step Prime Script RT-
7、PCR Kit（ Perfect Real Time， TAKARA)，含有 RT-PCR 缓冲液，酶混合物， dNTP 混合物，无 RNA 酶的水等。 3.2.12 M-MLV 反转录酶。 3.2.13 RNA 酶抑制剂。 3.2.14 TaqDNA 聚合酶。 3.2.15 dNTPs。 3.2.16 引物： RT-PCR 扩增引物 ,见 表 1； 实时荧光定量 RT-PCR 引物和探针 ，见 表 2。 表 1 RT-PCR扩增引物 引物名称 引物序列 DTMUV引物 P1 5- GCAACCAGGCAAAGAGGTCATA -3 DTMUV引物 P2 5- AAGTGAGCCTCATCCA
8、TAATGAACA -3 表 2 实时荧光定量 RT-PCR引物和探针 引物名称 引物序列 (5-3) DTMUV 引物 P3 AAGTCAGGCCAGGGAATCC DTMUV 引物 P4 CATGCACCCAGATTTGTTAACC DTMUV探针 FAM-CCGTCATCCAACATC-MGB 4 操作步骤与结果判定 4.1 样品采集与处理 4.1.1 组织器官 5.1.1.1 用无菌镊子和剪刀采集患病或病死禽类各种组织与器官（肝脏、卵巢、脑、脾脏、胸腺等）， 装入一次性塑料袋或其它灭菌容器，编号。 5.1.1.2 取待检组 织样品适量（ 0.1g），按 1:5 倍（ W/W）加入无菌
9、0.1M PH 7.4 PBS，于灭菌并烘干 的研钵或组织匀浆器中充分研磨，反复冻融 2次后， 4 ， 3000 r/min 离心 5 min，取上清 1 mL转至无 菌的 1.5 mL离心管中液，编号备用。 DB33/T 2247 2020 3 4.1.2 抗凝血、血清 4.1.2.1 抗凝血 用无菌注射器直接吸取全血，加入含抗凝剂（除肝素外）的抗凝管中，充分混匀，编号备用。 4.1.2.2 血清 用无菌注射器直接吸取全血，自然凝固， 3000 r/min 离心 5 min，取上清液 。 4.1.3 咽拭子、肛拭子 用无菌棉签刮取家禽的咽部或泄殖腔粘膜，放入含 0.1 M PH 7.4 PB
10、S的离心管内。 3000 r/min 离 心 5 min，取上清液，编号备用。 4.1.4 样品保存 制备样品在冷藏条件不宜超过 4 h，长期保存应放入 -70保存。 4.2 RNA提取 4.2.1 设立阳性、阴性样品对照，阳性对照为灭活的鸭坦布苏病毒感染 SPF 鸡胚尿囊液或者感染禽的 组织，阴性对照为正常 SPF 鸡胚尿囊液或者正常禽组织。 4.2.2 按下列步骤完成 RNA 提取，也可采用商品化 RNA 试剂盒提取 ： a) 样品处理好后，在样品处理区，取 n+2 个 1.5 mL DEPC 处理过的灭菌离心管，其中 n 为待检样 品数、 1 个阳性对照管和 1 个阴性对照管，对每个管进
11、行编号标记 ； b) 取 250 L 匀浆液，加入 750 L RNA 提取试剂 Trizol 置入一个 1.5 mL 离心管，震荡数次， 静置 5 min； c) 加入 200 L 预冷的氯仿，震荡混匀，室温静置 5 min， 4 12 000 r/min 离心 15 min； d) 吸取上层水相至一新离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温静置 15 min， 4 12 000 r/min 离心 15 min，离心后 在离心管边和底部可见有胶样 RNA 沉淀，弃上清 ； e) 吸弃上清，加入 500 L 75%乙醇，小心颠倒以漂洗沉淀及管壁，清洗 2 次， 4 12 000 r/min 离心
12、 5 min； f) 吸弃上清，沉淀置室温条件下干燥后，加入 20 L DEPC 处理水溶解 ； g) 提取的 RNA 应在 2 h 内进行 RT-PCR 扩增 ； 若需长期保存，需置于 -70 冰箱保存。 4.3 RT-PCR反应 4.3.1 一步法 RT-PCR 4.3.1.1 RT-PCR反应体系 设立阴性对照和阳性对照，按顺序加入表 3中的成分。 表 3 一步法 RT-PCR反应体系 试剂 体积 2 一步法 RT-PCR缓冲 液 12.5 L DTMUV引物 P1（ 20 mol/L） 0.5 L DTMUV引物 P2（ 20 mol/L） 0.5 L DB33/T 2247 2020
13、 4 表 3（ 续 ） 试剂 体积 RNA提取液 2.0 L 酶混合液 1.0 L DEPC水 8.5 L 4.3.1.2 反应条件 反转录： 50 30 min；预变性： 94 2 min；扩增： 94 30 s， 56 30 s， 72 30 s， 共 30个循环。 72 延伸 10 min。 4.3.2 两步法 RT-PCR 4.3.2.1 反转录 取 5 L RNA提取液 , 加 1 L DTMUV引物 P2， 70水浴 5 min； 冰浴 2 min，继续加入表 4中的成分， 37 水浴 1 h，合成 cDNA， 取出直接进行 PCR或置 -20保存。 表 4 反转录反应体系 试剂
14、体积 5 反转录反应缓冲液 4 L 0.1 mol/L DTT 2 L 2.5 mmol/L dNTPs 2 L M-MLV反转录酶 0.5 L RNA酶抑制剂 0.5 L DEPC水 5 L 4.3.2.2 PCR反应体系 先加入去离子灭菌水，然后再按照顺序逐一加入表 5中成分，每一次都应加入到液面以下。全部加 完后，混匀，瞬时离心， 使液体沉降到 PCR管底。 表 5 PCR反应体系 试 剂 体 积 反转录产物 1.25 L DTMUV引物 P1（ 20 mol/L） 0.5 L DTMUV引物 P2（ 20 mol/L） 0.5 L 10PCR Buffer 2.5 L 2.5 mmol
15、/L dNTPs 2 L TaqDNA聚合酶 0.25 L 灭菌去离子水 18 L 4.3.2.3 反应条件 DB33/T 2247 2020 5 预变性： 94 3 min；扩增： 94 30 s， 56 30 s， 72 30 s，循环 30次； 72延伸 10 min。 4.3.3 电泳 反应结束后，分别取 5 L各检测样品及阳性和阴性对照样品 RT-PCR产物并与 0.5 L加样缓冲液（ 10 Loading buffer）混合，然后加入到 1.0 %琼脂糖凝胶板的加样孔中，随后加 DNA分子量标准；以 5 V/cm 的电压进行电泳， 30 min后在紫外凝胶成像系统观察结果、拍照、记
16、录。 4.3.4 结果判定 5.3.4.1 阳性对照扩增出 567 bp 目的条带，且阴性对照无相应目的条带，判定试验成立，否则试验无 效。 5.3.4.2 被检测样品扩增出 567 bp目的条带，判定为阳性；未扩增出 567 bp目的条 带，判定为阴性。 4.4 实时荧光定量 RT-PCR 4.4.1 反应体系 设立阴性对照和阳性对照，按顺序加入表 6中的成分。 全部加完后，轻轻吹打混匀， 500 r/min 离 心 30s，使液体沉降到 PCR管底。 表 6 荧光定量 RT-PCR体系 试剂 体积 浓度 2One Step RT -PCR Buffer 10 L 1 TAKARA ExTa
17、q HS(5U/l) 0.4 L 2U Prime Script RT EnzymeMix 0.4 L / 10M DTMUV引物 P3 0.4 L 0.2 M 10M DTMUV引物 P4 0.4 L 0.2 M 50ROX Reference Dye 0.4 L 1 10M DTMUV探针 0.8 L 0.4 M RNA提取液 2 L / 灭菌去离子水 5.2 L / 4.4.2 反应条件 反转录： 42 5min；预变性： 95 10 s；扩增： 95变性 5 s； 58延伸 31 s，共 40个循环， 58 延伸时采集荧光信号。 4.4.3 荧光素的设定 Report Dye设定为 F
18、AM， Quencher Dye 设定为 MGB或 none。 4.4.4 结果判定 4.4.4.1 阈值设 定 直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩 增曲线的最高点为准。 DB33/T 2247 2020 6 4.4.4.2 质控标准 阳性对照的 Ct值 30.0，且出现典型的扩增曲线；阴性对照无 Ct值，且无典型扩增曲线。两者同时 成立时判定试验有效，否则试验视为无效。 4.4.4.3 结果描述及判定 4.4.4.3.1 阴性判定 无 Ct值并且无典型的扩增曲线，判为阴性。 4.4.4.3.2 阳性判定 Ct值 30，且出现典型的扩增曲线，判为阳性。 4.4.4.3.3 可疑判定 如果 30 Ct 38，判为可疑。此时 需重复扩增检测，如果重复检测出现典型的 扩增曲线且 Ct 38， 判样本为阳性，否则判样本 为阴性。 _
