1、ICS 65.020.30 B 40 DB33 浙江省 地方标准 DB33/T 2183 2019 家蚕核型多角体病抗性鉴定方法 Regulation of identification for silkworm nuclear polyhedrosis resistance 2019-01-15发布 2019-02-15实施 浙江 省市场 监督 管理 局 发布 DB33/T 2183-2019 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由浙江省 农业 农村 厅 提出 。 本标准由浙江省 种植业标准化技术委员会 归口。 本 标准 起草单位：浙江大学蚕蜂研究所、
2、浙江大学农业技术推广中心 、 浙江省农业技术推广中心 、 浙江省蚕种质量检验检疫站、 浙江省农业科学院蚕桑研究所、桐乡市蚕业有限公司 、浙江省种植业管理 局 。 本部分主要起草人： 鲁兴萌、周金钱、邵勇奇、楼霞、赵新华、谷利群、王永强、徐杰、张三妹 、 黄衍峰 。 DB33/T 2183-2019 1 家蚕核型多角体病抗性鉴定方法 1 范围 本标准规定了家蚕核型多角体病抗性 鉴定的 术语和定义 ， 家蚕核型病毒多角体试验用悬浮液的制备、 计数及 保存 ， 半数致死浓 度测定 ， 抗性鉴定评价。 本标准适用于家蚕一代杂交 种 的核型多角体病抗性评价。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用
3、是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅 注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 8170 数值修约规则与极限数值的表示和判定 DB33/T 2019 蚕种 生产技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本 标准 。 3.1 家蚕核型多角体病病毒 bombyx mori nuclear polyhedrosis virus 为杆状病毒科、真杆状病毒亚科、核型多角体病毒属的一种 。 3.2 家蚕核型多角体病病毒多角体 bombyx mori nuclear polyhedrosis virus and inclusion bo
4、dy 家蚕核型多角体病病毒在家蚕体内繁殖后， 形成包埋了大量病毒的多角体 ， 在生物光学显微镜下呈 六角形，并具有较强折光性。 3.3 家蚕核型多角体病 silkworm nuclear polyhedrosis 核型多角体病病毒在家蚕体内大量繁殖 ， 蚕体呈 乳白 色 、体躯肿胀、狂躁爬行、体壁易破典型病征 ， 或致死的病害 。 DB33/T 2183-2019 2 3.4 半数致死 浓度 median lethal concentration（ LC50） 在规定 时间 内，通过 添食 攻毒 感染 ，使 2龄 家蚕 半数死亡所需的病毒多角体浓度。 3.5 攻毒 challenge test
5、 以人工添毒的方法，将 病毒多角体悬浮液均匀涂抹于桑叶 背面 ， 喂饲家蚕使之感染 。 3.6 抗性指数 resistance index 用于衡量参试蚕品种抗性的指数，以参照品种 LC50平均值为 100R。 4 家蚕饲养 按 DB33/T 2019中简化催青 的要求 催青 ， 常规饲养至 2龄起蚕 。 5 家蚕核型病毒多角体试验用悬浮液的制备、计数及 保存 5.1 悬浮液的制备 5.1.1 添食 将纯化的病毒多角体，用蒸馏水配成 1106个 /毫升浓度的攻毒液。 取 3 片 大小约 10 cm10 cm清洁 桑叶，用脱脂小棉球蘸 取 5 ml， 均 匀涂抹在每 片 桑叶背面 ， 喂饲 10
6、0头 4龄起蚕，基本食净后 (约 12 h)， 改用清洁桑叶喂饲。在 24 25 的温度下，饲养 7 d 10 d备用。 5.1.2 制备 从饲养的 攻 毒蚕中 ，选择有体色乳白和体躯肿胀典型病征，但 尚未出现狂躁爬行病症和皮破之前 ， 用剪刀 从 病蚕的腹足 或 尾角收集其体液， 经 2层脱脂纱布过滤，然后将滤液用 3000 r/min离心 10 min， 弃上清；沉淀用无菌生理盐水充分悬浮后，再用 3000 r/min离心 10 min，弃上清；重复离心 3 次 5次， 至沉淀呈较为均质的乳白色，再用少量无菌生理盐水充分悬浮，即成病毒多角体悬浮 液 。 5.2 病毒多角体的计数 用血球计数
7、板计数 病毒 多角体悬浮液中多角体的数量，并用无菌生理盐水调成 1109个 /毫升 的 病毒 多角体悬浮液母液，直接使用或置 4 冰箱内备用。 5.3 病毒多角体 悬浮 液 的保 存 5.3.1 保存 方法 DB33/T 2183-2019 3 将 病毒 多角体悬浮液 置 4 保存 。 5.3.2 保 存 时间 病毒 多角体悬浮 的有效保存 时间为 2年 。 6 半数致死 浓度 测定 6.1 攻毒 用多角体悬浮液的配 制 将 病毒 多角体悬浮液母液（ 1109个 /毫升 ）用无菌生理盐水稀释成 1109个 /毫升、 1108个 /毫升 、 1107个 /毫升 、 1106个 /毫升 和 110
8、5个 /毫升 的 稀释 病毒 多角体悬浮液。也可采用类似的其它 10倍梯度 方法制作 稀释 病毒 多角体悬浮液。 病毒多角体悬浮液母液及梯度稀释液的有效 保存 时 间为 1 个月。 6.2 攻毒 对象和 设区 6.2.1 攻毒 对象 测试蚕品种、对照蚕品种的 2龄起蚕 。 6.2.2 攻毒设区 设 5个 10倍稀释浓度 病毒 多角体悬浮液，每个浓度设 3个重复区，每个重复区 30头蚕。同时设无菌生 理盐水添食作对照区。 6.3 攻毒 添 食与饲养 取 1片 清洁适龄桑叶 ， 切成约 5cm5cm的方块 叶 ， 用 小 脱脂棉球 将 200 L的 病毒 多角体悬浮液均匀 涂抹在 方块 叶背 面
9、后 喂食 。待桑叶基本食净（ 约 12 h）后，改 饲 清洁桑叶，在 25 27 的温度下饲 养。 6.4 病死蚕计数 6.4.1 校验 对照 区 有非核型 病毒 多角体病因素引起的 异常 ， 试验 重做。 6.4.2 病死蚕统计 从 2 龄起蚕 攻毒开始 到 2 眠眠起止， 为 病死蚕计数 时间 。 有核型 病毒 多角体病典型病征的蚕 ， 计为 病死蚕 ；没有典型病征的 3龄起蚕 ， 计为健康蚕 。 对不能确定的 迟 眠蚕，取 其 血用显微镜 检查， 检到有 家蚕 核型病毒 多角体的，计入病死蚕 。计算各浓度区 的 死亡率和平均死亡率。 6.5 半数致死 浓度 的计算 半数致死浓度（ LC5
10、0）的计算 ， 采用 Reed-Muench法。 .(1) 式中： DB33/T 2183-2019 4 LC50 半数致死浓度 ； DU50 死亡率超过 50%试验组的 累计 死亡率 ； DD50 死亡率低于 50%试验组的 累计 死亡率 ； logN 稀释因子的对数； DU50-log 累计 死亡率超过 50%试验组的 病毒 多角体悬浮液浓度对数 。 7 抗性鉴定评价 7.1 抗性参照蚕品种 抗性参照蚕品种 设 2个，菁松 皓月 (正反交 )、 秋丰 白玉 (正反交 )。参照品种与待鉴定评价品种同 步试验，按照本标准第 6章计算 LC50。 7.2 抗性 指数 以 2个 参照蚕品种的 LC
11、50平均值为 100R，再根据待测蚕品种的 LC50换算出该品种的抗性指数。 7.2.1 参照蚕品种的半数致死浓度平均值 RLCCKLCCKLCCKLCCKC K L C 1004 50450350250150 . (2) 式中： CKLC50 参 照品种的半数致死浓度平均值 ； CK1LC50、 CK2LC50、 CK3LC50、 CK4LC50 2个 对照品种 （正反交） 的半数致死浓度 ； 100R 对照种 抗性 指数 。 7.2.2 待测蚕品种的抗性指数 RCKLCTG LCTG I 1005050 . (3) 式中： TGI 待测蚕品种 的 抗性 指数 ； TGLC50 待测蚕品种的
12、半数致死浓度 ； CKLC50 对照品种的半数致死浓度平均值 。 7.3 抗性等级评级 按照 表 1对家蚕品种的核型多角体病毒抗性等级作出鉴定评价 。 表 1 家蚕对核型多角体病毒的抗性等级 核型多角体病抗性等级 抗性 指数 应用建议 超强 (Ultrastrong) 1600R 可在家蚕核型多角体病流行严重的蚕区饲养 强 (Strong) 201R 1600R 可在家蚕核型多角体病流行较 严重 的蚕区饲养 一般 (General) 50R 200R 可在非家蚕核型多角体病流行的蚕区饲养 弱 (Weak) 50R 慎用 DB33/T 2183-2019 5 8 数据修约 按 GB/T 8170要求，保留 2位小数。 _
