1、ICS 65.020.20 B 05 备案号： DB32 江苏省 地 方 标 准 DB32/T 3627 2019 菊花种质资源离体保存技术规程 Technical Regulation for conservation of chrysanthemum germplasm in vitro 2019-07-11 发布 2019 -08-01 实施 江苏省市场监督管理局 发布 DB32/T 3627 2019 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由南京农业大学提出并归口。 本标准起草单位：南京农业大学、南京 华之彩 园艺 有限公司 。 本标准主要起草人：
2、房伟民、陈发棣、管志勇、蒋甲福、王 海滨 、邓波、 范志 欣。 DB32/T 3627 2019 1 菊花种质资源离体保存技术规程 1 范围 本标准规定了菊花种质资源离体保存的术语和定义、基本要求和常温生长离体保存 、低温生长离体 保存、超低温离体保存方法及再生与检测方法等。 本标准适用于菊花种质资源的离体保存，菊属其他种质资源保存可参照执行。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 1491 花卉植物病毒检测规程 3 术语和定义 下列术语和定义
3、适用于本文件。 3.1 常温离体 保存 conservation at room temperature in vitro 在 常温（ 25 2 ）下 保存 正常生长的离体保存物的方式。 3.2 低温离体 保存 conservation at low temperature in vitro 通过低温 条件 、改变 培养基 成分或添加 抑制型植物生长调节物质 等 手段以延缓保存物 生长速度 的离 体保存方式 。 3.3 超低温离体 保存 cryopreservation 在液氮（ -196 ）中 保存 离体材料，使之 代谢 和生长 基本 停止 ， 生物学状态 相对 稳定 的离体保存 方 式。
4、4 材料要求 4.1 基本要求 保存的材料应符合以下要求： a）用于保存的材料应该保证品种纯 正，来源可靠，基本性状清楚，且未发生变异。 DB32/T 3627 2019 2 b) 依据 D NY/T 1491 规定的方法进行病毒检测，确保材料不携带菊花 B病毒（ CVB）、番茄不孕 病毒（ TAV）、菊花矮化类病毒（ CSVd）、菊花褪绿斑驳类病毒（ CChMVd）等。 4.2 材料登记 要求 保存的材料应进行信息登记，内容包括种质名称 或编号 、产地或 产权单位（ 人 ） 、引种情况、保存 情况 等 （见 附录 A） 。 5 常温 离体 保存 5.1 保存材料 选择符合 4.1 条件的材料
5、 并按照 4.2 要求 详细登记，利用 生根培养 30 d 左右 、 生长整齐一致的无菌 苗为材料，切割成带 2 个 3个 节的茎段 供 保存。 5.2 保存容器 采用规格为直径 (18 30) mm长 (160 200) mm的试管，用内置硅胶圈的密封塑料盖或封口膜封 口，贴好标注保存编号的标签。 5.3 保存条件 MS 培养基均附加 0.3 mg/L 6-BA、 0.1mg/L NAA、 30 g/L 蔗糖和 7 g/L 琼脂， pH 6.0。置于温度 （ 252） 、光照强度 2000 lx 3000 lx、光照时间 12 h/d 的条件下培养。每管加培养基 15 mL 25 mL。 5
6、.4 保存数量 每份种质 5管以上，每管 1个 2个 茎段 。 5.5 继代时间 视不同种质的生长速度， 每 2个 3个月继代 1次。 5.6 技术指标 变异率 2%；无菊花 B病毒（ CVB）、番茄不孕病毒（ TAV）、菊花矮化类病毒（ CSVd）、菊花褪绿 斑驳类病毒（ CChMVd）。 6 低温离体保存 6.1 保存材料 同 5.1。 6.2 保存容器 同 5.2。 6.3 保存条件 根据种质特点，下列两种方法可以选用一种 : a) 减少培养基养分水平法：低温（ 52） 下， 1/4MS 或 1/2MS+0.3 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L DB32/T 3
7、627 2019 3 蔗糖 +7 g/L 琼脂，该方法适宜地被、盆栽型菊花种质资源。 b) 添加抑制 型植物生长调节物质法：低温（ 52） 下， MS+0.3 mg/ 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖 +7 g/L 琼脂，培养基中添加 20 mg/L 80 mg/L ABA，或者 15 g/L 20 g/L 甘露醇；地被、盆栽型 资源宜添加低剂量 ABA 或甘露醇，切花型资源宜采用较高剂量。 6.4 保存数量 同 5.4。 6.5 继代时间 视不同种质的生长速度，每 8个 12个月继代 1次。 6.6 技术指标 变异率 2%；无菊花 B病毒（ CVB）、番茄不孕病毒（ T
8、AV）、菊花矮化类病毒（ CSVd）、菊花褪绿 斑驳类病毒（ CChMVd）。 7. 超低温离体保存 7.1 保存材料 选择符合 4.1条件的材料并按照 4.2要求详细登记，利用生根培养 30 d左右、生长整齐一致的无菌苗 为材料 ，切成 0.5 cm 1 cm，含 2个以上腋芽，在 MS培养基附加 30 g/L 蔗糖和 7 g/L 琼脂， pH 6.0，温度 （ 252） 、光照强度 2000 lx 2500 lx、光照时间 16 h/d，培养 2 w 3 w。 7.2 保存容器 采用规格为直径 (15 20)mm长 (120 160) mm试管，用内置硅胶圈的密封塑料盖，贴好标注保 存编号
9、的标签。 7.3 分离茎尖 在无菌条件下，通过解剖镜逐层剥去外层叶片 ,切取 1 mm 2 mm大小的茎尖。 7.4 保存数量 每份种质 5管以上，每管 8个 10个茎尖。 7.5 预培养 茎尖分别接种到含 0.4 mol/L 蔗糖浓度的 MS 培养基内， 4 暗培养 3 d。 7.6 装载 将无菌棉纸放置在培养皿中，用装载溶液 (附录 B)湿润。将 8个 10个菊花茎尖包在棉纸中，迅速浸 入装载溶液中，室 温（ 252） 下暗 处理 30 min，取出后用无菌滤纸吸去多余装载液。 7.7 脱水 将包有茎尖的棉纸团转入玻璃化保护剂 PVS2（附录 B），冰浴条件下处理 15 min。 7.8
10、冷冻保存 DB32/T 3627 2019 4 将脱水（玻璃化）处理后包有茎尖的棉纸团转移至装有预冷新鲜玻璃化试剂 PVS2的冷冻管中 ,密封 塑料盖并用封口膜封口，迅速投入液氮中保存。 7.9 技术指标 冻后再生率 20%，变异率 1%；无菊花 B 病毒（ CVB）、番茄不孕病毒（ TAV）、菊花矮化类病 毒（ CSVd）、菊花褪绿斑驳类病毒（ CChMVd）。 8. 再生与检测 8.1 超低温保存材料的再生 8.1.1 化冻 在无菌条件下，快速将冷冻管从液氮转移至 40 水浴中，剧烈震荡 120 s。然后将 包有茎尖的棉纸 团从 冷冻管取出，在经灭菌的干燥滤纸放置 30 s。 8.1.2
11、卸载 将化冻后 包有茎尖的棉纸团转移到卸载液（附录 B），室 温（ 252） 下放置 10 min，中间 5 min 时换一次卸载液。然后将棉纸团展开， 茎尖在卸载液中悬浮 5 min。 8.1.3 再生 用含蔗糖 1.2 mol/L 的 MS 液体培养基洗涤 20 min,滤纸吸干后接种到含 0.1 mg/L BA 和 0.01 mg/L NAA 的 MS 固体或半固体培养基中 ,在（ 252） 条件下暗培养或弱光培养 1 d 3 d 后转入正常光照培 养条件下培养 2-3 周。 8.2 检测 8.2.1 病毒检测 保存再生后代的病毒检测按照 NY/T 1491 的方法进行。 8.2.2 变
12、异率检测 取定植 2 个月后植株心叶， CTAB 法提取 DNA，采用 20.0L PCR 反应体系，包括 10Buffer 2.0 L， 5mmol/L Mg2 1.5 L， 10 mmol/L dNTP Mixture 0.8 L， 5U/l Taq 酶 0.2 L， 20 mol/L ISSR 随机扩 增引物 0.5 L， ddH2O 13.0 L，模板 DNA 2.0L。所用的扩增反应程序为 95 预变性 5 min， 94 变 性 45 s； 53 复性 40 s； 72 延伸 70s， 45 个循环， 72 延伸 7 min，最后 4 保存。电泳结束 后 凝胶成像 系统分析仪中观察
13、并拍照，比较离体保存苗与对照苗的条带差异。 DB32/T 3627 2019 5 附录 A （资料性附录） 菊花种质 资源离体保存登记表 表 A.1 菊花种质 资源离体保存登记表 种质名称或 编号 （中文 ） 种质名称或 编号 （英文 ） 其他 名称 原产 地 或 引种单位 产权单位（ 人 ） 来源 地 或 引种 单位 引种人 引种 时间 引种数量 采集号或 引种号 保存号 保存 方法 保存时间 保存数量 保 存 者 继代 次数 继代时间 保存 数量 操作 人 DB32/T 3627 2019 6 附录 B （资料性附录） 菊花种质超 低温离体保存 溶液的 配制 B.1 装载液 MS 培养基 184ml/L 甘油 137g/L 蔗糖， pH 5.8， 0.22m 滤膜过滤灭菌。 B.2 PVS2 溶液 MS 培养基 300ml/L 甘油 150ml/L 乙二醇 150ml/L 二甲基亚砜（ DMSO） 137g/L 蔗糖， pH 5.8， 0.22m 滤膜过滤灭 菌。 B.3 卸载液 MS 培养基 411g/L 蔗糖， pH 5.8， 0.22m 滤膜过滤灭菌。 _
