1、 ICS 65.020.30 B 40 江 苏 省 地 方 标 准 DB32 DB32/T 3686 2019 山羊副流感病毒 3 型检测技术规程 Technical regulations for detection of Caprine parainfluenza virus 3 2019 -12-04 发布 2019-12-25 实施 江苏省市场监督管理局 发布 DB32/T 3686 2019 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由江苏省农业科学院提出 并归口 。 本标准起草单位：江苏省农业科学院。 本标准 主要 起草人：李文良、毛立、李基棕、郝飞
2、、刘茂军 、杨蕾蕾、孙敏 。 DB32/T 3686 2019 1 山羊副流感病毒 3 型检测技术规程 1 范围 本标准规定了山羊副流感病毒 3型 （ Caprine paraifluenza virus 3, CPIV3） 的 病原学检测（病毒 核酸 的 RT-PCR和荧光定量 RT-PCR检测 ） 、 血清学检测（ 血凝抑制（ HI）试验 ） 的技术要求。 本标准适用于山羊 副流感病毒 3型 及其感染情况 的实验室 检测 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修订单）适
3、用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 病原学检测 3.1 材料 微量移液器及吸头 、 DEPC水处理的离心管、吸头、 PCR扩增管 、 TRIzol试剂 、 三氯甲烷 、 异丙醇 、 DEPC处理水 （用水符 合 GB/T 6682规定）、 反转录酶 /Taq DNA聚合酶混合液 、 2一步法 RT-PCR反应缓 冲液 、 一步法荧光定量 RT-PCR试剂盒 、 TAE缓冲液 、 琼脂糖 、 核酸染料 、 引物 MF/MR、 引物 qMF/qMR 与探针（附录 A）
4、。 3.2 仪器设备 PCR 仪、 荧光定量 PCR 仪 、 台式冷冻离心机、电泳仪和水平电泳槽、凝胶成相仪（或紫外透射仪） 。 3.3 反转录 -聚合酶链式反应（ RT-PCR） 3.3.1 样品处理 与 RNA 的提取 采集 羊 的鼻拭子、气管拭子或肺脏 （样品的采集、保存和运输应符合 NY/T 541相关规定） 。 取 200 L待检 样品液至 无菌无 RNA酶的 EP管中 ， 使用 TRIzol试剂 、 RNA提取试剂盒或自动化核酸提取仪 等方 法提取 RNA。 3.3.2 RT-PCR 反应 RT-PCR反应 使用 20 L体系 ： 10 L 2一步法 RT-PCR反应缓冲液 、 引
5、物 MF/MR各 0.5 L（ 10 mol/L） 、 0.4 L反转录酶 /Taq DNA聚合酶混合液 、 4 L RNA模板， 4.6 L DEPC处理水。反应条件为： 45 反转录 30 min； 94 预变性 2 min； 94 30 s， 54 30 s， 72 30 s， 进行 35个循环 ； 72 延伸 10 min。 3.3.3 结果判定 取 PCR产物 10 L，在 1.2%琼脂糖凝胶中进行电泳，在凝胶成像系统中观察结果。样品 PCR检测产 物电泳后 有大小为 346 bp的片段判断为山羊副流感病毒 3型核酸阳性 ，无条带判断为阴性 。 每次试验应 设置阴阳性对照，阴阳性对照
6、应不出现或出现相应大小的条带。 DB32/T 3686 2019 2 3.4 荧光定量反转录 -聚合酶链式反应（荧光定量 RT-PCR） 3.4.1 核酸提取与荧光定量 RT-PCR反应 核酸提取 同 3.3.1。荧光定量 RT-PCR反应 使用 20 L体系 ： 10 L 2一步法 反应缓冲液 ， 0.4 L反转 录酶， 0.4 L DNA聚合酶， 引物 qMF/qMR各 0.4 L（ 10 mol/L） ， 0.8L探针， 0.4L染料， 2 L RNA 模板， 5.2 L DEPC处理水 。 将 PCR管 置于 荧光定量 PCR仪器上进行 RT-PCR扩增 ， 程序 如下 ： 42 5
7、min； 95 10 s； 95 5 s， 60 34 s， 共进行 40个循环。 3.4.2 荧光定量 RT-PCR结果判定 阳性对照扩增曲线呈标准的 S曲线，且 Ct值 30。阴性对照扩增曲线应为基线下的水平线。若样本 曲 线呈 S形曲线，且 Ct值 38为阳性 ；未出现扩增曲线为阴性 。 4 血清学检测 血凝抑制（ HI）试验 4.1 材料 微量移液器 及配套吸头、 96孔 V型微量反应板、生理盐水、 1%豚鼠红细胞悬液 （配制方法见附录 B） 、 病毒液（相关试验操作应符合 GB 19489的要求）、 标准阳性血清、标准阴性血清。 4.2 仪器设备 离心机、恒温培养箱。 4.3 病毒血
8、凝效价测定 每次 HI试验前应对病毒血凝效价进行测定，检测与判定方法如下： 在反应板一排各孔中加 25 L 生理盐水 ； 第一孔中加 25 L病毒分离液，按照 1:2倍 比稀释，最后一孔不加抗原作阴性对照。每孔中再加 25 L PBS； 每孔加 25 L 1%豚鼠红细胞液， 37 孵育 40 min； 当红细胞被凝集时，红细胞均匀分布在反应板底部，反应板倾斜片刻，红细胞不下滑；红细胞 未被凝集时，反应板倾斜片刻，可见沉淀的红细胞向下滑动，形成流线。 HA效价 为全部红细 胞出现凝集时的最高稀释倍数。 4.4 HI 试验 按如下方法进行 HI 试验： 在 96 孔 V 型微量反应板各孔中加 25
9、 L生理盐水 ； 加 25 L经处理的血清于第一孔中，混匀后取 25 L加到第 2 孔中，依次倍 比稀释，从第 2 孔 加至第 11 孔，第 11 孔混匀后吸取 25 L弃去，最后 1 孔不加血清 作为 对照 ； 每孔中加 25 L 4个 HA 单位 的病毒 抗原， 37 孵育 40 min； 每孔加 25 L 1%豚鼠红细胞液， 37 孵育 40 min。 4.5 结果判定 将反应板倾斜 70度 左右 ， 若 无凝集反应，则沉淀的红细胞向下滑动，呈流线状，记录为抗体阳性。 完全抑制凝集的抗体最高稀释倍数为血清的 HI抗体 滴度。 抗体滴度大于等于 16为阳性，小于等于 8为阴性。若检测发病后
10、双份血清（第一份血清应在临床症 状出现后立即采集，第二份 血清在两周后采集），抗体滴度上升 4倍或 4倍以上时，表明羊只近期被感染。 DB32/T 3686 2019 3 附录 A （资料性附录） 引物 A.1 引物序列 表 A.1 用于 RT-PCR和荧光定量 RT-PCR检测的引物、探针 引物 靶基因 序列（ 5-3） 产物 MF M 基因 AGTGATCTAGATGATGATCCA 346bp MR M 基因 GTTATTGATCCAATTGCTGT qMF M 基因 GCTTGGCTTCTTTGAAATGG 150bp qMR M 基因 GCCTGCAGAAGTTCCTTGTC CPI
11、V3 Probe M 基因 FAM-CAATCGGACTAGCCAAGTATGGTGGGA-TAMRA A.2 引物的溶解 引物 MF、 MR、 qMF、 qMR用灭菌 的 DEPC处理水 溶解到浓度为 10 mol/L； CPIV3 Probe用灭菌 的 DEPC处理水 溶解到浓度为 10 mol/L。 DB32/T 3686 2019 4 附录 B （资料性附录） 1%豚鼠红细胞的配制 B.1 生理盐水配制方法 氯化钠（ NaCl） 0.9 g 去离子水加至 100 mL， 121 高压灭菌 15 min，冷却后保存于 2 8 冰箱中备用。 B.2 1%豚鼠细胞悬液制备 无菌采集豚鼠血液，置于 EDTA抗凝管中混匀， 2 8 保存。使用前吸取红细胞悬液置离心管中， 加入生理盐水洗涤 3次，每次以 2000 r/min离心 5 min，将血浆、白细胞等充分洗去，沉积的红细胞用生 理盐水稀释成 1%的悬液，保存于 2 8 冰箱中备用。
