1、ICS 65.020.30 B 40 DB32 江 苏 省 地 方 标 准 DB32/T 3685 2019 猪萨佩罗病毒检测技术规程 Detection technical regulation for Porcine Sapelovirus 2019 - 12 - 04 发布 2019 - 12 - 25 实施 江苏省市场监督管理局 发布 DB32/T 3685 2019 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由江苏省农业科学院 提出并归口。 本标准起草单位：江苏省农业科学院。 本标准主要起草人： 李彬、范宝超、孙杰、何孔旺、郭容利、 周金柱、 俞正玉
2、。 DB32/T 3685 2019 1 猪萨佩罗病毒检测技术 1 范围 本标准规定了猪萨佩罗病毒的核酸检测（ RT-PCR法）、血清学检测（间接 ELISA方法）等要求。 本标准规定的 RT-PCR法适用于本病毒的抗原确诊，间接 ELISA试验适用于血清学的普查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修订单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 541 动物疫病实验室检验采样方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 猪
3、萨佩罗病毒 Porcine Sapelovirus（ PSV） 单股 正链 RNA病毒，属于小 RNA病毒科萨佩罗病毒属。该病毒能引起中度或严重的神经系统紊乱、 腹泻、繁殖障碍和肺炎，感染猪康复后仍然会继续排毒，成为重要的病毒传播源，因此该病毒在猪群中 感染率很高，严重威胁着养猪业的健康发展。 4 核酸检测（ RT-PCR 法） 4.1 材料准备 PCR 引物 P1 5- GAGAAGGTAAAGATGGGCAAAAC - 3 和 P2 5- AATACAGGATGACACAGGAAGGG- 3（见附录 B）。 PCR相关试剂。猪萨佩罗病毒阳性病料 RNA提 取物反转录为 cDNA作为阳性对照
4、 ，水作为阴性对照。高速离心机（ 10000 r/min）、 PCR仪、电泳仪、 水平电泳槽凝胶成像系统（或紫外投射仪）、移液器等仪器。 4.2 操作步骤 4.2.1 DNA模板制备 按 NY/T 541规定的方法，采集待检猪的病料置于 -20 以下冰箱保存。临床组织病料样品加入 1PBS 缓冲液进行充分研磨后冻融 3次，高速 10000 r/min离心 5 min，取上清提取病毒总 RNA（参照 RNA提取试 剂盒说明书），并反转录成 cDNA（利用反转录试剂盒），保存备用。 4.2.2 PCR DB32/T 3685 2019 2 PCR反应体系： 2xTaq Master Mix 12.
5、5 L， P1（ 20 pmol/L） 1.0 L， P2（ 20 pmol/L） 1.0 L，模 板 2 L 5 L，加 ddH2O至总体积 25 L。反应条件：预变性 94 5min， 94 30s，扩增的退火温度分 别采用 55 进行扩增 30 s， 72 30 s， 35个循环 72 延伸 10 min。 4.2.3 电泳 制备 1 %琼脂糖凝胶，内加适量溴化乙锭或其替代物，取 PCR产物 10 L 20 L分别与适量加样 缓冲液混合后，加样到电泳孔中， 9 V/cm恒压下电泳 15 min 30 min。将电泳好的凝胶放到紫外投射仪 或凝胶成像系统上观察结果。 4.3 结果判定 阳性
6、对照扩增到 689 bp条带，同时阴性对照无条带时，试验成立。 在试验结果成立的前提下，如果样品扩增到 689 bp条带，可确认为样品为猪萨佩罗病毒 PCR阳性。 4.4 废弃物处理和防止污染的措施 检测过程中的废弃物，应做好无害化处理，检测过程中防止交叉污染的 措施见附录 A。 5 血清学检测（间接 ELISA 方法） 5.1 材料准备 猪萨佩罗病毒重组 3C表达抗原，酶标抗体，标准阴性血清、标准阳性血清，酶标板及其他必要的 试验溶液和酶标仪、移液器等仪器。待检血清样品采集于疑似患病猪场。 5.2 操作步骤 5.2.1 包被：用包被液将猪萨佩罗 3C蛋白抗原稀释到工作浓度加入酶标板孔内，每孔
7、 100 L， 4 冰箱 过夜。 5.2.2 洗涤：甩掉酶标板孔内的液体，加入洗涤液 200 ul/孔，室温下浸泡 5 min，甩去洗涤液，再重新 加入洗涤液，连续洗 3次，最后一次甩掉洗涤液 后，拍干酶标板。 5.2.3 封闭：各孔加入 5%的脱脂乳封闭液 200 L， 37 作用 2 h。按 5.2.2步骤洗涤四次。 5.2.4 加入待检血清和阴、阳性血清对照：待检血清用稀释液 1:320稀释，每孔加 100 L。同时将阴、 阳性血清作对照。 37 作用 45 min，重复 5.2.2步骤，洗涤 4次。 5.2.5 加入酶标抗体：用稀释液将酶标抗体按 1:10000稀释，每孔加入 100
8、L， 37 作用 30 min，重复 5.2.2 步骤，洗涤 4次。 5.2.6 加入底物，每孔加 100 L，室温避光显色 8 min。 5.2.7 终止反应，每孔加入 50 L终止液终止反应。 5.2.8 测定光吸收值 (OD)，在酶联免疫检测仪上于 450 nm波长处测定光吸收值 (OD)。 5.3 结果判定 用酶标仪检测 OD值，计算 S/P值， S/P值 =（样品血清 OD450 nm值 -阴性血清 OD450nm值） /（阳性 血清 OD450 nm值 -阴性血清 OD450 nm值）。当样品 S/P值 0.212时判为 阳性； 0.150样品 S/P值 0.212时，判为疑似。 DB32/T 3685 2019 3 _
