1、ICS 65.020.30 B 40 DB32 江 苏 省 地 方 标 准 DB32/T 3685 2019 猪萨佩罗病毒检测技术规程 Detection technical regulation for Porcine Sapelovirus 2019 - 12 - 04 发布 2019 - 12 - 25 实施 江苏省市场监督管理局 发布 DB32/T 3685 2019 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由江苏省农业科学院 提出并归口。 本标准起草单位:江苏省农业科学院。 本标准主要起草人: 李彬、范宝超、孙杰、何孔旺、郭容利、 周金柱、 俞正玉
2、。 DB32/T 3685 2019 1 猪萨佩罗病毒检测技术 1 范围 本标准规定了猪萨佩罗病毒的核酸检测( RT-PCR法)、血清学检测(间接 ELISA方法)等要求。 本标准规定的 RT-PCR法适用于本病毒的抗原确诊,间接 ELISA试验适用于血清学的普查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修订单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 541 动物疫病实验室检验采样方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 猪
3、萨佩罗病毒 Porcine Sapelovirus( PSV) 单股 正链 RNA病毒,属于小 RNA病毒科萨佩罗病毒属。该病毒能引起中度或严重的神经系统紊乱、 腹泻、繁殖障碍和肺炎,感染猪康复后仍然会继续排毒,成为重要的病毒传播源,因此该病毒在猪群中 感染率很高,严重威胁着养猪业的健康发展。 4 核酸检测( RT-PCR 法) 4.1 材料准备 PCR 引物 P1 5- GAGAAGGTAAAGATGGGCAAAAC - 3 和 P2 5- AATACAGGATGACACAGGAAGGG- 3(见附录 B)。 PCR相关试剂。猪萨佩罗病毒阳性病料 RNA提 取物反转录为 cDNA作为阳性对照
4、 ,水作为阴性对照。高速离心机( 10000 r/min)、 PCR仪、电泳仪、 水平电泳槽凝胶成像系统(或紫外投射仪)、移液器等仪器。 4.2 操作步骤 4.2.1 DNA模板制备 按 NY/T 541规定的方法,采集待检猪的病料置于 -20 以下冰箱保存。临床组织病料样品加入 1PBS 缓冲液进行充分研磨后冻融 3次,高速 10000 r/min离心 5 min,取上清提取病毒总 RNA(参照 RNA提取试 剂盒说明书),并反转录成 cDNA(利用反转录试剂盒),保存备用。 4.2.2 PCR DB32/T 3685 2019 2 PCR反应体系: 2xTaq Master Mix 12.
5、5 L, P1( 20 pmol/L) 1.0 L, P2( 20 pmol/L) 1.0 L,模 板 2 L 5 L,加 ddH2O至总体积 25 L。反应条件:预变性 94 5min, 94 30s,扩增的退火温度分 别采用 55 进行扩增 30 s, 72 30 s, 35个循环 72 延伸 10 min。 4.2.3 电泳 制备 1 %琼脂糖凝胶,内加适量溴化乙锭或其替代物,取 PCR产物 10 L 20 L分别与适量加样 缓冲液混合后,加样到电泳孔中, 9 V/cm恒压下电泳 15 min 30 min。将电泳好的凝胶放到紫外投射仪 或凝胶成像系统上观察结果。 4.3 结果判定 阳性
6、对照扩增到 689 bp条带,同时阴性对照无条带时,试验成立。 在试验结果成立的前提下,如果样品扩增到 689 bp条带,可确认为样品为猪萨佩罗病毒 PCR阳性。 4.4 废弃物处理和防止污染的措施 检测过程中的废弃物,应做好无害化处理,检测过程中防止交叉污染的 措施见附录 A。 5 血清学检测(间接 ELISA 方法) 5.1 材料准备 猪萨佩罗病毒重组 3C表达抗原,酶标抗体,标准阴性血清、标准阳性血清,酶标板及其他必要的 试验溶液和酶标仪、移液器等仪器。待检血清样品采集于疑似患病猪场。 5.2 操作步骤 5.2.1 包被:用包被液将猪萨佩罗 3C蛋白抗原稀释到工作浓度加入酶标板孔内,每孔
7、 100 L, 4 冰箱 过夜。 5.2.2 洗涤:甩掉酶标板孔内的液体,加入洗涤液 200 ul/孔,室温下浸泡 5 min,甩去洗涤液,再重新 加入洗涤液,连续洗 3次,最后一次甩掉洗涤液 后,拍干酶标板。 5.2.3 封闭:各孔加入 5%的脱脂乳封闭液 200 L, 37 作用 2 h。按 5.2.2步骤洗涤四次。 5.2.4 加入待检血清和阴、阳性血清对照:待检血清用稀释液 1:320稀释,每孔加 100 L。同时将阴、 阳性血清作对照。 37 作用 45 min,重复 5.2.2步骤,洗涤 4次。 5.2.5 加入酶标抗体:用稀释液将酶标抗体按 1:10000稀释,每孔加入 100
8、L, 37 作用 30 min,重复 5.2.2 步骤,洗涤 4次。 5.2.6 加入底物,每孔加 100 L,室温避光显色 8 min。 5.2.7 终止反应,每孔加入 50 L终止液终止反应。 5.2.8 测定光吸收值 (OD),在酶联免疫检测仪上于 450 nm波长处测定光吸收值 (OD)。 5.3 结果判定 用酶标仪检测 OD值,计算 S/P值, S/P值 =(样品血清 OD450 nm值 -阴性血清 OD450nm值) /(阳性 血清 OD450 nm值 -阴性血清 OD450 nm值)。当样品 S/P值 0.212时判为 阳性; 0.150样品 S/P值 0.212时,判为疑似。 DB32/T 3685 2019 3 _