1、ICS 65.080 B 13 备案号： DB32 江苏省 地 方 标 准 DB32/T 3628 2019 木霉固态菌种生产技术规程 Technical regulation for production of solid Trichoderma spp. spawn 2019 -07 -11 发布 2019 -08 -01 实施 江苏省市场监督管理 局 发布 DB32/T 3628 2019 I 前 言 本标准按 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由南京农业 大学提出并 归口。 本标准 起草单位 ：南京农业大学。 本标准主要起草人：沈其荣、刘东阳、黄启为、李荣、 凌宁 。
2、DB32/T 3628 2019 1 木霉固态菌种生产技术规程 1 范围 本标准规定了木霉固态菌种生产中所涉及的 生产 场地要求、 生产 流程、 产品 检测、 建立 生产档案、 包装及贮存运输要求等技术环节。 本标准适用于木霉固态菌种的生产。 2 规范性引用文件 下列文件 对于 本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 191 包装储运图示标志 GB 3095 环境空气质量标准 GB 3838 地表水环境质量标准 GB 20287 农用微生物菌剂 NY/T 883 农用微生物
3、菌剂生产技术规程 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 固态菌种 solid spawn 生长在固态培养基料上的菌种。 3.2 微生物接种剂 microbial inoculant 一种或一种以上的目的微生物经工业化生产增殖后直接使用 ， 或经浓缩或经载体吸附而成的活菌制 品。 3.3 固体培养基 solid medium 以富含木质纤维素或淀粉类天然物质为主要原料，添加适量的有机氮源及无机盐类，具一定水分含 量的培养基。 4 生产 场地要求 DB32/T 3628 2019 2 4.1 生产基地选择 生产基地应远离居住区、城区等，并且交通便利， 生态环境优良，周边植被覆盖率高
4、。生产地块集 中连片并位于原料收集区较近的地方。车间保温保湿性能良好，同时具备通风性能。 4.2 生产环境 厂区空气质量达到大气环境质量标准 GB 3095中 II类标准要求。 发酵用水达到地表水质量标准 GB 3838中 III类水质要求，冷却水及其他用水应达到标准 IV类水质要 求。 4.3 生产车间 4.3.1 原料库 原料库要求水电方便，平坦干燥、通风良好，光照充足、空旷宽阔，远离火源 ， 注意防火设施的建 设。 4.3.2 接种室 接种室必须设缓冲间，通风和保温性能良好，并具有防尘换气性能，墙内壁和屋顶光滑，必须做好 杀菌消毒工 作，确保接种室环境的相对无菌。 4.3.3 培养室 培
5、养室内壁和屋顶光滑，便于清洗与消毒，有条件的单位可以建设半地下室的培养室，或者将培养 室墙壁加厚，有利于培养室的控温。 4.3.4 检验室 检验室 宜 留出便于检验仪器设备安装的场所，同时水电布局要求合理 ， 建立车间环境卫生制度 ， 定 期 对 生产设备和环境消毒的。 5 生产流程 5.1 技术环节 木霉固态菌种 主要 包括木霉高密度液体发酵、固体基质准备、接种木霉液体菌种、固体发酵的控制、 固态菌种后处理、产品包装、质量检测及出厂等技术环节 。 具体工艺流程见附录 A。 5.2 菌种要求 5.2.1 原种 原种是生产用菌种的母种，对原种 有如下要求： 原种 应 有菌种鉴定报告 。 原种 应
6、 有菌种的企业编号、来源信息等。 5.2.2 菌种 保管 采用固体曲保藏和冻干管保藏的方法保藏木霉固体孢子，确保无杂菌污染，菌种不退化。分类纯化 并定期检查，建立菌种档案。 DB32/T 3628 2019 3 5.2.3 菌种质量控制 在进行生产之前，应对所使用的菌种进行检查，并确认其纯度和性能没有发生退化，如出现污染或 者退化情况，该菌种不能作为生产用菌种，应该按照标准 NY/T 883执行 。 5.3 液体发酵增殖 木霉菌种的液体发酵增殖，按照 NY/T 883执行 。具体的培养基见附录 B。 木霉菌丝体采用棉兰染色法观察：在载玻片中央 滴加一滴无菌水，并将菌丝体均匀分布其中，盖上 盖玻
7、片，尽量不留气泡，从一侧滴加少量的棉兰染色液染色 5 min，染色结束后用无菌水慢慢冲洗染色 液，表面风干后在显微镜下观察，染色液配方具体见附录 C。菌丝清晰可见 ， 生长良好 ，没有出现杂菌 污染，可以作为菌种继续使用；如果菌丝细小并呈不规则分布或者有杂菌污染，应按标准 NY/T 883处 理 。 5.4 固体培养基 制备 5.4.1 培养基要求 发酵培养基要求接种后木霉菌丝体生长旺盛，在保证有一定的生物量（菌丝体）的前提下兼顾分生 孢子及有效代谢产物的产生。 原料 要求 来源充足、价格合理、营养成分充足 ， 宜 采用农作物秸秆及农用氨基酸作为主要原料。 5.4.2 制备过程 5.4.2.1
8、 秸秆前处理 以农作物秸秆作为发酵基质，使用前晾干（含水率约 15%，含有机质约 65%）并用粉碎机将其粉碎 成 0.3 cm 0.4 cm长的片段。 5.4.2.2 氨基酸添加 往上述秸秆中添加氨基酸稀释液，氨基酸稀释液的添加量为每 100 g晒干后的秸秆加入 100 200 mL 的氨基酸稀释液（氨基酸原液总氨基酸含量 10%），调节起始 pH为 3.0 4.0，物料的含水率应该严格 控制在 50% 60%之间，陈化 4 h 6 h后备用。 5.4.3 灭菌 5.4.3.1 高压蒸汽灭菌要求 固体发酵培养基物料灭菌温度为 121 130 ，灭菌时间为 1.0 h 2.0 h；或者采用 10
9、0 灭菌 2 h 4 h， 24 h后再灭菌一次。 5.4.3.2 灭菌效果检测 将 1 g固体发酵 产 物加入到 9 mL无菌水中 ， 充分混匀后制 成 悬液 ， 吸取 1 mL悬液加入到装有已灭菌 的 9 mL营养肉汤的试管中，并做至少三个生物学重 复，将试管置于 37 恒温培养箱中避光培养， 24 h 内无浑浊、镜检无菌体后即可判定彻底灭菌，反之则判定为灭菌不彻底，不可用于固体发酵。 5.5 接种 DB32/T 3628 2019 4 固体发酵培养基高温蒸汽灭菌后，待其降至室温，尽快将灭好菌的固体发酵培养基 转移至固体发酵 培养室。将发酵好的木霉菌丝体按 5%的接种量（ v/w，鲜重）接
10、种到固体发酵培养基料中并充分拌匀， 分装到不同的浅盘当中，并将塑料浅盘转移到具有控温控湿功能的发酵室内进行培养。 5.6 发酵 控制 5.6.1 培养温度 固体发酵的温度应该严格控制在（ 282） ，根据不同木霉发酵特性和生长代谢特征，适当调整 到最佳的发酵温度。 5.6.2 物料含水率 固体发酵初期，最适宜的物料含水率应该控制在 50% 60%之间，发酵结束后，发酵产品的含水率 应该控制在 20% 40%之间。 5.6.3 空气湿度 固体发酵过程中，空气湿度 宜 严格控制在 70% 75%之间 。 5.7 发酵终点判断 5.7.1 物理性状 采用 感观 法评价 固体发酵物料的颜色、形态和气味
11、 。 5.7.2 孢子定量 5.7.2.1 稀释涂布 以无菌操作取样 25 g转 至 225 mL无菌 生理盐水 中， 并充分震荡后制成 1： 10的菌悬液。 并 利用梯度 稀释法进行 样品 稀释 ， 吸取最后的稀释液 0.1 mL于木霉 选择 性培养基上 （ 见附录 B） ，并用涂布棒将菌 悬液涂布均匀。 5.7.2.2 培养 在 28 恒温培养箱中避光培养 2 d 3 d，注意观察菌落的生长情况 。 5.7.2.3 计数 记录 各平板的菌落总数，求出不同稀释度平板中的平均菌落数，计算出每克原始样品中的菌落 数。 固体发酵产物中有效活菌数含量 4.0109个 /克。 6 产品检测 6.1 有
12、效活菌数检测 按照 5.7.2的方法检测发酵产物中的有效活菌数。 6.2 杂菌率检测 杂菌率的检测按照 GB 20287执行，木霉固体发酵产物的杂菌数应 1.0104个 /克。 DB32/T 3628 2019 5 6.3 其他项目检测 固体发酵物的细度、有害元素含量（ Hg、 Pb、 Cd、 Cr、 As）、 pH（ 5.5 7.5） 、大肠杆菌数、蛔 虫卵死亡率值达到 NY/T 883的要求。 7 建立生产档案 每批次生产的产品，必须建立完善的生产档案，包括产品检验项目、检验结果、实验人、批准人以 及检验日期等准确信息。 8 包装及贮存运输要求 8.1 包装 包装标签按 GB/T 191规
13、定执行。 8.2 贮存 产品应贮存于阴凉干燥处，环境温度 不宜 超过 30 ， 并避免与化肥、农药等 一同贮存 。 8.3 运输 在运输过程中应注意防潮、防晒、防破裂。 DB32/T 3628 2019 6 附 录 A （ 规范 性附录） 木霉固态菌种生产技术规程 示意图 退化 污染 发酵 原种 菌种纯度检测及其功能 分析 原种纯化 原种复壮 发酵 过程的 优化与控制 液体菌种 的检测 检测不合格 检测合格 按规定处理 固体发酵过程 中发酵参数的 优化与控制 主 要 包括 pH 、 含水率、发酵 时间等 固体菌种 包装 质量 检验 检测不合格 检测合格 按规定处理 出厂 DB32/T 3628
14、 2019 7 附 录 B （规范性附录） 培养基及其配方 原种培养基及其配方： 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 （ PDA培养基 ） ，其中马铃薯 200 g煮沸后取滤液， 葡萄糖 20 g，琼脂 25 g，水 1000 mL， pH调整为 5.0。 摇瓶种子培养基及其配方： 马铃薯 葡萄糖液体培养基，其中马铃薯 200 g煮沸后取滤液，葡萄糖 20 g， 水 1000 mL， pH调整为 5.0。 液体发酵培养基及其配方： 土豆 150 kg/T、蔗糖 15 kg/T、玉米粉 5 g/T、 (NH4)2SO4 5 kg/T、 MgSO47H2O 0.5 kg/T、 KH2PO4 1kg/T、 pH
15、自然； pH调整为 5.0。 固体发酵培养基： 农作物秸秆（优选水稻秸秆和玉米秸秆 ， 含水率约 15%，含有机 质 量约 65%） 晾 干后用粉碎机将其粉碎成 0.3 cm 0.4 cm长的片段；往上述秸秆中添加氨基酸稀释液，氨基酸稀释液的 添加量为每 100 g晒干后的秸秆加入 100 mL 200 mL的氨基酸稀释液（相当于 100 g晒干后的秸秆中加入 10 mL 20 mL的氨基酸水解液原液 ， 氨基酸原液中总氨基酸的含量 10%），调节起始 pH为 3.0 4.0， 初始含水率严格控制在 50% 60%之间，陈化 4 h 6 h后备用（可以对秸秆进行预处理，更利 于 木霉利 用秸秆
16、） 。 木霉选择性培养基 ： 蛋白胨 5.0 g/L，葡萄糖 10.0 g/L，磷酸二氢钾 1.0 g/L，硫酸镁 0.5 g/L，琼脂 20.0 g/L，孟加拉红 0.033 g/L；上述培养基使用前 ，加入氯霉素 0.1 g/L，五氯硝基苯（ 75%可湿性粉剂） 0.2 g/L， 1%链霉素（ w/v） 9mL， 霜霉威 0.2 g/L。 DB32/T 3628 2019 8 附 录 C （规范性附录） 染色液及其配方 石炭酸 10 g，乳酸 （ 比重 1.21） 10 mL，甘油 20 mL，蒸馏水 10 mL，棉蓝 0.02 g，将石炭酸加在蒸馏 水中加热溶解，然后加入乳酸和甘油，最后加入棉蓝，使其溶解，放置过夜后，用双层滤纸过滤置于 4 冰箱保存。 _
